端粒酶分析方法的研究进展*

董雪梅，贺　锐，章国平，蒲巍林 综述,杜晓钟 审校

(甘肃省妇幼保健院， 兰州 730050)



·综述·

端粒酶分析方法的研究进展*

董雪梅，贺锐，章国平，蒲巍林 综述,杜晓钟△审校

(甘肃省妇幼保健院， 兰州 730050)

端粒；端粒酶；端粒酶活性；测定方法

端粒和端粒酶是近年来生命科学研究的热点之一,其在肿瘤临床检测与治疗中已得到广泛研究，但在生殖领域尚属起步阶段。人端粒酶活性(TA)是精子发生高度敏感性和特异性的标志物，生殖细胞中端粒酶的检测特别是对原发性无精子症患者睾丸灶性精子发生的诊断具有重要的临床意义[1]。

1　TA检测的研究进展

TA的早期检测是Morin[2]建立的端粒重复序列延伸法，即利用端粒酶自身反转录合成端粒末端片断的特性进行端粒合成,然后通过加入Rnase破坏端粒模板，采用12%聚丙烯酰胺电泳分离，放射显影可见阳性条带。该方法稳定性较好，但所需标本量大，敏感性差，实验复杂,所需时间长。

Kim等[3]建立端粒重复扩增法(TRAP)，该法将端粒酶的反应产物应用聚合酶链反应(PCR)大量扩增，使测定的敏感性提高了约10 000倍，是近年来被全世界普遍采用的方法，但该法需将扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行放射显影，因使用放射性同位素标记，易有放射性污染且价格昂贵，方法十分繁杂，临床推广应用受到一定限制。

1996年德国Boehringer公司用标记地高辛探针检测端粒酶扩增产物，推出端粒酶-ELISA检测试剂盒，该法极大简化了PCR产物检测操作步骤，4 h内即可得到检测结果，但试剂盒不同批号间常出现较大差异，且试剂价格极为昂贵，临床无法常规应用。虽现已有公司提供地高辛标记的引物，但该试剂是否稳定，尚待进一步探讨。

2　TA的改进检测技术

目前研究TA定量检测方法是为了减少繁锁费时的PCR检测步骤，改进循环条件，提高敏感性和线性。端粒酶表达常见方法有电泳法和酶免法。

2.1改良端粒重复序列扩增(TRAP)-银染法利用端粒酶在体外的RNA模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加6 个碱基的重复序列特性，采用PCR 方法扩增此重复序列，并进而用聚丙烯酰胺凝胶电泳显示6 个碱基差异的梯带。根据Kim等[3]的端粒重复片段扩增方法，首先合成1个18 nt 的TS 做上游引物，端粒酶结合TS 末端的GTT 并合成AGGGTTAG，然后每经过1次转位合成1个GGTTAG的6核碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入CX 做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。阳性结果在凝胶电泳上显示相隔6 bp 的梯状条带，条带的多、寡、深或浅表示TA大小。采用银染方法用于TRAP-PCR标记染色，既解决了同位素的放射性污染问题，又简便、安全、省时，敏感性较溴化乙锭染色高5～10倍[4]。另外，硝酸银染色仅在可见光下即可观察，实验结果还可经凝胶干燥后长期保存。因此，该方法有望成为生殖细胞TA检测及恶性实体瘤早期诊断、高危患者筛选及微转移癌灶的追踪等新的分子生物学方法。

2.2聚合酶链反应-酶免法(PCR-ELISA)检测原理为端粒酶自带模板将端粒重复片段(TTAGGG)加到生物素标记、人工合成的P1-TS-引物的3′端，经PCR反复扩增P1-TS和P2引物间的特异产物，产生含有端粒酶特异的6核苷酸重复序列的PCR产物。将PCR产物变性后，与地高辛标记，并对端粒重复片段特异的探针杂交，杂交产物通过生物素标记的引物固定在抗菌药物蛋白包被的微孔板上。然后采用与过氧化物酶结合的抗地高辛抗体(Anti-DIG-POD)检测经固定的PCR产物。最后加入过氧化物酶的反应底物TMB，便可产生一着色反应产物，测定450 nm和690 nm的吸光度(A)值。根据公式A=A450-A690。

端粒酶PCR-ELISA方法简单、方便、敏感，PCR扩增以后，通过特异性探针与PCR变性产物杂交而检测，特异性强，可以避免PCR反应后的假阳性和假阴性，且易于定量，是检测TA较理想的方法，将有更广泛的临床应用前景。

2.3荧光素-抗荧光素系统检测法由于荧光素标记引物较为简便、稳定，用荧光素-抗荧光素系统代替地高辛-抗地高辛耦联法，效果良好。该法有较好的敏感性与重复性，较银染法更为简便快速，无同位素污染，检测成本低，有较好的推广应用价值。

2.4端粒酶相关功能蛋白的检测目前研究发现TA至少受端粒酶RNA(hTR)、端粒酶相关蛋白(TP1/TLP1)及端粒酶催化亚单位(hTERT)的影响。hTR 是合成端粒DNA的模板，提供模板合成端粒重复序列。端粒酶在其3′端生成451个核苷酸的转录产物。反转录是在5′末端46～53个核苷酸处发生，该反应靠近端粒DNA序列。分析hTR的2级结构，可预测TA。目前用以预测hTR的2级结构的方法是研究hTR的4个构成组件，包括 CR2/CR3结构域,aCR4/CR5 结构域, H/ACA (CR6/CR8)盒,CR7 结构域[5]。TP1/TLP1的功能尚未阐明，可能不仅是结构蛋白，还是一种调节端粒酶与其他分子相互作用的调节亚单位。hTERT是TA调节的主要部分，对TA表达及维持端粒长度起决定性作用。有学者使用TaqMan荧光检测系统建立了实时定量RT-PCR检测hTERT相关基因表达。

2.5TA相关调节因子检测TA在人体细胞受到严格的调控，这个调控过程涉及一些蛋白激酶，如hTERT基因在体外磷酸化的蛋白激酶AKT，被确定为TA负调节的蛋白激酶c-ABL。蛋白激酶C家族的成员是端粒酶反转录酶在体外磷酸化，导致TA，刺激hTERT启动子活性的关键酶。激酶SRC作为TA的负调节，负责hTERT在氧化应激反应过程中的磷酸化反应。其他几个激酶(如ERK1/2和JNK)也被认为负责TA调控，但其作用机制尚不清楚[6-9]。

3　结　　语

近年来，有关端粒酶的研究异常活跃，绝大多数生物细胞DNA的端粒随着细胞分裂而缩短，当缩短到一定长度，即达到危机点时，细胞不再分裂而衰老、死亡,少数细胞逃逸危机点，激活端粒酶，从而永生或恶变[10]。正常机体细胞中TA不表达，而在干细胞、生殖细胞和90%的恶性肿瘤细胞中却特异性地表达[11-13]。随着对端粒酶结构、功能及调控的深入研究，其在细胞永生化及癌变中的作用也有了新的认识，生殖细胞中可检测到TA，端粒酶在人类生殖发育中发挥着重要作用，可通过端粒酶的研究来探索影响人类生殖能力的相关因素及机制，以期对人类生殖功能、胚胎质量进行监控。有研究表明，端粒酶RNA基因在男性不育症患者睾丸组织中的表达与生殖细胞的分布定位一致，在精细胞不发育患者睾丸组织中无端粒酶RNA基因的表达，提示TA的缺乏可能是生殖细胞发育停滞的原因之一[14]。

目前，端粒酶分析方法尚缺乏标准化，随着端粒酶检测技术的进一步发展，可制订TA定性及定量的标准化检测方法，从而研究端粒酶的表达在相关疾病监测、疗效和预后判断中的作用。深入研究端粒酶在男性生殖生理及病理学意义，探讨激素及其他药物治疗的端粒酶机制，使端粒酶技术成为诊断及治疗男性生殖疾病的重要手段之一。

[1]杜晓钟，陕文生，郑雷．少弱精子症患者精浆中精子及睾丸组织端粒酶活性实验研究[J]．国际检验医学杂志，2011，32(12)：1277-1278．

[2]Morin GB.The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats[J].Cell,1989,59(3):521-529.

[3]Kim N,Piatyszek M,Prowse K,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer[J].Science,1994,266(5193):2011-2015.

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[12]Shay JW,Bacchetti S.A survey of telomerase activity in human cancer[J].Eur J Cancer,1997,33(5):787-791.

[13]Hiyama E,Gollahon L,Kataoka T,et al.Telomerase activity in human breast tumors[J].Natl Cancer Inst,1996,88(2):116-122.

[14]叶哲伟，陈晓春，范民，等．男性不育症患者睾丸组织中端粒酶RNA表达状况的研究[J]．华中科技大学学报(医学版)，2003，32(1)：58-61．

甘肃省自然科学基金资助项目(ZS031-A25-065-E)。

，E-mail:dxzh5678@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.032

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1673-4130(2016)19-2738-03

2016-02-18

2016-06-13)