TaqMan荧光定量PCR检测新型隐球菌方法的建立

韩　慧,黄福达,张秀明,吴炳义

(1.中山大学附属中山医院/中山市人民医院检验医学中心，广东中山 528403；2.南方医科大学附属南方医院临床医学实验研究中心，广州 510515)



·论著·

TaqMan荧光定量PCR检测新型隐球菌方法的建立

韩慧1,黄福达1,张秀明1,吴炳义2△

(1.中山大学附属中山医院/中山市人民医院检验医学中心，广东中山 528403；2.南方医科大学附属南方医院临床医学实验研究中心，广州 510515)

目的建立TaqMan荧光定量PCR方法定量检测新型隐球菌基因组DNA，为检测隐球菌性脑膜炎提供重要方法。方法在国家生物技术信息中心(NCBI)查找新型隐球菌各亚型的ITS-rDNA序列，序列比对后设计特异性引物和探针，扩增片段为114 bp，构建质粒标准品，调整质粒浓度为1.42×108copy/μL ～ 1.42×10 copy/μL共8个浓度梯度，分别取2 μL作为模板，优化反应条件，建立标准曲线，进行敏感性、特异性、重复性评价，并检测临床确诊的15例隐球菌脑膜炎感染菌株。结果建立的荧光定量PCR可以检测2.84×102拷贝的质粒DNA，对临床分离的各10例其他真菌、细菌、乙型肝炎病毒DNA和人类基因组DNA均无扩增曲线，重复性良好，3个浓度的批间变异系数分别为2.86%、1.48%、1.36%，可准确检测15例新型隐球菌。结论成功建立检测新型隐球菌的荧光定量PCR方法，敏感性和特异性较高，结果稳定可靠，可早期、快速诊断隐球菌性脑膜炎。

荧光定量PCR；新型隐球菌；基因组DNA

新型隐球菌是一种条件致病菌，主要通过呼吸道进入肺部，引起炎性或隐性感染。机体免疫功能降低，侵袭中枢神经系统，导致隐球菌性脑膜炎。由于该病早期无明显症状和体征，脑脊液变化不典型，很难与其他疾病相鉴别，易被误诊而延误治疗。新型隐球菌脑膜炎的确诊主要依据脑脊液墨汁染色检测新型隐球菌，但早期涂片染色阳性率低，因此建立一种早期、快速诊断隐球菌的方法至关重要[1-3]。

1　材料与方法

1.1一般材料新型隐球菌菌株来自广州市微生物研究所和检验科临床分离的菌株，脑膜炎双球菌、白色念珠菌、热带念珠菌、黄曲霉、黑曲霉各10例及乙型肝炎病毒DNA和人类基因组DNA各2例作为阴性对照(检验科)。酵母基因组DNA提取试剂盒(北京天根)，溶壁酶(东盛生物)，Premix Ex TaqTM和pMD20-T载体购自TAKARA，荧光定量PCR仪器为Stratagene MX3005P。

1.2引物和探针在国家生物技术信息中心(NCBI)查找新型隐球菌各亚型的ITS-rDNA序列，比对后找出其共同的保守序列设计引物和探针，探针5′端标记荧光报告基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团TAMRA，序列上游引物：5′-GTT GGA CTT GGA TTT GGG TGT T-3′ ；下游引物：5′-GGC CCA GCG AAA CTT ATT ACG-3′ 。TaqMan探针：5′-FAM-CGA CCT GCA AAG GAC GTC GGC TC-T AMR A-3′，扩增片段长度为114 bp。引物和探针由上海生工合成。

1.3DNA提取和质粒构建新型隐球菌株及隐球菌感染的脑脊液标本接种在沙保罗液体培养基中，37 ℃振荡培养24 h，取2 mL离心留沉淀，使用溶壁酶和基因组DNA提取试剂盒提取DNA。采用上、下游引物扩增DNA模板，应用PCR产物，按照pMD20-T载体试剂盒说明，连接后转入DH5α大肠杆菌的感受态细胞内，涂板，筛选阳性克隆，华大生物公司测序，经测序鉴定为目的质粒。使用核酸测定仪测定质粒浓度，计算质粒拷贝数，运用无菌去离子水进行10倍梯度稀释，每个梯度做3个重复，同时以无菌去离子水为空白对照，以2.84×108～2.84×102拷贝作标准曲线。

1.4荧光定量PCR反应体系反应体系为25 μL，Premix 12.5 μL，上、下游引物(终浓度10 μmol/L)各0.5 μL，探针(终浓度10 μmol/L)为1 μL，内参染料ROX 0.5 μL，模板2 μL，去离子水补足至25 μL，同时做空白对照。反应条件为95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环。

1.5标准曲线制作和敏感性将构建的新型隐球菌质粒定量后，进行10倍的梯度稀释，调整浓度为1.42×108copy/μL～1.42×10 copy/μL，分别取2 μL作为模板，每个梯度做3个重复，按照上述建立的反应条件进行检测，反应结束后以最低检测浓度值作为检测敏感性，同时仪器自动绘制标准曲线。

1.6荧光定量PCR特异性按上述反应条件同时检测脑膜炎双球菌、白色念珠菌、热带念珠菌、黄曲霉、黑曲霉等DNA，检测乙型肝炎病毒DNA和人类基因组DNA，观察扩增结果。提取15例隐球菌患者脑膜炎的脑脊液标本DNA，使用上述引物和探针进行检测。

1.7荧光定量PCR重复性选取1.42×107、1.42×105、1.42×103copy/μL 3个浓度为模板，每天进行1次实验，每次每个梯度做3次重复，连续检测3 d，使用同一台PCR仪器，根据CT值计算CV值，观察重复性和稳定性。

2　结　　果

2.1荧光定量PCR标准曲线构建新型隐球菌质粒测序图及对比结果，以每个反应浓度2.84×108～2.84×102拷贝制作标准曲线，扩增曲线良好，各浓度与CT值之间呈很好的负相关关系，标准曲线Y=-3.354log(X)+45.73，相关系数为0.998，说明具有很好的线性关系。

2.2荧光定量PCR的敏感性调整质粒的浓度为1.42×108copy/μL～ 1.42×100copy/μL，分别取2 μL作为模板，在2.84×108～2.84×102拷贝浓度范围内，起始模板的浓度与CT值呈负相关关系和线性关系，因此敏感性为2.84×102拷贝的质粒DNA。

2.3荧光定量PCR的特异性应用建立的PCR方法扩增脑膜炎双球菌、白色念珠菌、热带念珠菌、黄曲霉、黑曲霉、乙型肝炎病毒DNA和人类基因组DNA，结果显示均无任何扩增曲线，说明特异性良好。检测脑脊液提取的DNA，提示均有较好的扩增曲线，表明设计的引物和探针可准确检测新型隐球菌致病菌株。

2.4荧光定量PCR的重复性选取3个浓度进行检测，连续3 d检测3次，每次均做3个重复，2.84×107拷贝的CT值为(20.99±0.60)，CV值为2.86%，2.84×105拷贝CT值为(28.32±0.42)，CV值为1.48%，2.84×103拷贝CT值为(34.38±0.47)，CV值为1.36%，3个浓度的批间CV值均小于5%，说明重复性和稳定性优良。

3　讨　　论

近年来，由于抗菌药物和免疫抑制剂的大量应用，脑膜炎的发病率呈上升趋势，特别是病死率高的隐球菌性脑膜炎，其病情较严重，但早期临床表现、生化指标缺乏特异性，与结核性脑膜炎、病毒性脑膜炎临床表现相似，易误诊，且晚期缺乏有效的治疗药物，致残率和病死率极高[4]。目前墨汁染色显微镜检查和脑脊液培养仍是隐球菌脑膜炎诊断的金标准，但实际应用中阳性率低，敏感性和特异性差、耗时长，且应进行抗菌药物治疗的患者不易检出阳性结果，而脑膜炎患者的治疗效果和预后，与其能否早期诊断和合理治疗密切相关。

以PCR为基础的核酸扩增技术已逐渐应用于临床，成为实验室快速诊断方法，其已广泛应用于真菌性疾病的诊断[5-7]，也逐渐应用于隐球菌感染的诊断[8-9]。该方法敏感性高、特异性强，可以早期从少量标本中检出病原菌，与传统培养法比较，可快速、可靠、高敏感性和高特异性地诊断感染性疾病[10-11]。

本研究采用荧光定量PCR探针法，通过比对各亚型的ITS-rDNA序列，依据保守序列设计特异性引物和探针，该方法较普通PCR操作简单，自动化程度高，无需后续的电泳，极大地减少了反应产物的污染，整个反应过程2 h内即可完成。特异性强，与其他真菌、细菌、病毒和人类基因组DNA均无交叉反应。敏感性高，最低可检测284个拷贝的质粒DNA，根据扩增曲线和CT值观察结果，通过标准曲线可准确定量起始模板量。使用该方法检测5例脑脊液分离菌株，均有明显的扩增曲线，说明设计的引物和探针能准确应用于临床标本检测。在今后的研究工作中，应检测更多的脑脊液标本以评价该方法的临床应用价值。

本研究建立的TaqMan探针法荧光定量PCR检测新型隐球菌基因组DNA，具有良好的敏感性、特异性、重复性，可早期准确地诊断隐球菌性脑膜炎，为临床诊断和治疗提供重要的依据。

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Establishment of TaqMan probe real-time PCR for detection of Cryptococcus neoformans

HANHui1,HUANGFuda1,ZHANGXiuming1,WUBingyi2△

(1.CenterofLaboratoryMedicine,ZhongshanHospitalofSunYat-senUniversity,Zhongshan,Guangdong528403,China;2.ResearchCenterofClinicalMedicine,NanfangHospitalAffiliatedofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510515,China)

ObjectiveTo establish TaqMan probe real-time Fluorescent Quantitative PCR in detecting Cryptococcus neoformans genomic DNA,and to provide important method for detection of cryptococcal meningitis.MethodsAccording to the Cryptococcus neoformans ITS-rDNA sequences obtained from NCBI,specific primers and probe were designed based on the conserved sequences,a specific 114 bp fragment was amplified by primers and probe,then recombinant plasmid was constructed.Eight different concentrations from 1.42×10 copy/μL to 1.42×10 copy/μL were used as templates by 2 μL.In the optimum reaction condition,the sensitivity，specificity and repeatability were evaluated and standard curve was established.15 clinical cryptococcal meningitis strains isolated from clinical diagnosis patients were detected.ResultsThe real-time PCR showed high sensitivity and specificity and was able to detect 2.84×102copies of plasmid DNA.The detection sensitivity was 2.84×102copies plasmid DNA by real-time PCR,no amplification curve was detected with human genomic DNA,other fungus,bacterias and viruses.TheCVof inter-assay were 2.86%，1.48% and 1.36% respectively with excellent reproducibility.Fifteen clinical isolated strains could be detected accurately.ConclusionA method of detection of Cryptococcus neoformans DNA by real-time PCR is established successfully with high sensitivity and specificity,and the results are stable,could diagnose cryptococcal meningitis rapidly and early.

real-time PCR;Cryptococcus neoformans; genomic DNA

韩慧，女，主管技师，主要从事临床血液研究。

，Email:wubingyi66@126.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.015

A

1673-4130(2016)19-2697-03

2016-02-13

2016-04-24)