大鼠肾移植慢性排斥反应模型的简易改进

熊玉龙，姚宏伟，许贤林

(常州市第一人民医院泌尿外科，江苏 常州 213000)



大鼠肾移植慢性排斥反应模型的简易改进

熊玉龙，姚宏伟，许贤林*

(常州市第一人民医院泌尿外科，江苏 常州 213000)

摘要：目的 建立稳定简易的大鼠肾移植慢性排斥反应模型。方法 用F344大鼠作为供肾鼠，Lewis大鼠作为受体鼠，采取肾动、静脉端端吻合术，输尿管膀胱瓣与受体膀胱吻合术。术后皮下注射环孢素A 5mg/kg连续10天，10天后切除对侧肾脏。结果 手术时间约100～120min，手术成功率92.1%，受体存活8周以上。结论 我们改进的大鼠慢性排斥反应模型可以稳定建立，手术成功率高，可用于肾移植慢性排斥相关研究。

关键词：大鼠；肾移植；慢性排斥反应；动物模型

大鼠肾移植模型是研究肾移植相关的移植物排斥、免疫抑制、移植肾功能等必要的研究工具。Fisher早在1965年创立了大鼠肾移植模型[1]，不久White等人使用F344大鼠与Lewis大鼠成功建立了大鼠CAN模型(chronic allograft nephropathy)[2]。国内报道陈金芝于1981年也成功建立了大鼠肾移植模型[3]，近些年所研究的大鼠肾移植模型大多是急性排斥反应模型，由于慢性排斥反应一般需要大鼠存活4～12周，因此对手术中器官冷热缺血时间，围手术期处理要求更高。我们总结了国内外大鼠慢性排斥反应模型的手术经验，并结合自身经验改进了该模型。现报告如下。

1材料与方法

1.1材料选用200g左右F344和Lewis雄性大鼠作为供受体(购于苏州大学实验动物中心)[4]，温暖通风条件下饲养。双人双目显微镜(苏州六六视觉科技股份有限公司)，显微手术器械(上海医疗器械集团有限公司)，3-0、7-0、10-0无损伤缝线(上海浦东金环医疗用品股份有限公司)。10%水合氯醛，4°C肝素钠等渗盐水(25U/mL)，HC-A离体肾保存液。

1.2手术步骤

1.2.1术前准备术前禁食12h，自由饮水。大鼠腹腔注射10%水合氯醛3ml/kg，麻醉生效后固定于大鼠固定板，取腹部正中切口。用自制简易拉钩拉开腹壁，将肠管用湿棉签轻轻拉出，以温生理盐水纱布包裹。

1.2.2摘取供肾分离暴露并结扎左肾上腺动静脉，游离左肾动静脉。游离腹主动脉上下端，并于腹主动脉分出肾动脉、髂动脉前分别留线待结扎，游离输尿管膀胱并剪取直径3mm的膀胱瓣。肾静脉近端结扎剪断，结扎腹主动脉留线，使用自制的插管(1mL注射器针头尖磨平)将4°C肝素钠等渗盐水吊高1.2m经腹主动脉灌注肾脏(图1)(封三)，可以观察到肾脏变成黄褐色。灌注过程中可修剪供肾肾蒂，近端离断肾动脉，随后将供肾置于HC-A离体肾保液中4°C保存。

1.2.3受体移植取受体鼠麻醉、固定，过程同供体鼠。游离左肾动静脉，分别用无创微血管夹夹闭近端，远端剪断。包膜下切除左肾，将冷藏的供肾用4°C生理盐水浸泡过的小纱布包裹置于供体的左肾窝。调整好位置后4°C肝素钠等渗盐水冲洗血管腔而后用10-0无损伤缝线端端吻合左肾动静脉。①动脉采用连续缝合间断打结法，先于动脉断端两侧各缝一针作为标志线。连续缝合一面不拉紧，之后分别剪断缝线最后一起打结，牵拉标志线翻转断端同法缝合背侧。每一面需要4～5针，针隙过大时适当补针。②静脉采用连续缝合，先于静脉断端两侧各缝一针。连续缝合腹侧面，最后打结时候需要牵拉两端标志线使缝线均匀分布。翻转断端，同法缝合背侧面。③松开无创微血管夹，数秒钟之后可观察到大鼠肾脏由土黄色变成粉红色。④输尿管膀胱瓣吻合，在供体鼠膀胱上剪开适当大小圆孔，7-0无损伤缝线两定点法连续缝合膀胱瓣。腹腔内加入2mL温生理盐水、20万单位青霉素，3-0缝线分别缝合肌层、皮肤。术后复温2h后放回笼中，当天晚上给予5%葡萄糖盐水自由饮用。肌注青霉素20万单位3d，皮下注射环孢素A 5mg/kg连续10d，10d后切除对侧肾脏。分别于4周，8周，12周处死大鼠取移植肾做病理检查。

2结果

经过反复对手术方式的调整，模型的热缺血时间<30s，冷缺血时间<20min。供体手术时间20～30min，动脉吻合时间<25min，静脉吻合时间<20min，总时间100～120min。模型手术成功率达92.1%，移植肾标本8周质地变硬，明显变大。镜下单核细胞增多，小动脉内膜呈同心圆增生，肾小球、肾小管间质纤维化改变明显，符合Banff 97慢性排斥反应表现(图2)(封三)。

3讨论

3.1血管吻合方法国内外大鼠肾移植血管吻合的手术方法有很多种，主要分为端端吻合和端侧吻合两大类。端侧吻合将肾动、静脉与腹主、下腔静脉端侧吻合，此法影响了受体鼠的全身血液循环。我们认为端端吻合并没有因为血管细小而使得缝合变难，相反，端端吻合受体鼠不需要去分离腹主动脉旁结构，大大降低损伤到身体大血管的危险，也使得手术过程得以简化。臧崇森等[5]认同动脉端端吻合，主张静脉使用Cuff套管吻合。我们实际操作中发现Lewis大鼠静脉十分粗大，Cuff套管因为血管管径大小问题局限性很大[6]。刘皎林等[7]认为肾移植动静脉端端吻合最符合生理特点，并发症最少。我们动脉采用连续缝合间断打结法，此法可以省略间断缝合需要不停调针的麻烦，在助手帮助下可缩短动脉缝合时间5～10min。

3.2尿路重建方法Daniller[8]使用了输尿管内套管进行尿路重建，但此法会导致严重的输尿管缺血坏死。输尿管带膀胱瓣与受体膀胱吻合的方法首次见于Silber[9]，并取得满意的移植效果。此法需要注意输尿管周围脂肪清除太多会影响血供，熟练使用显微剪可以迅速分离输尿管膀胱。另一种常见的尿路重建术即输尿管端端吻合术，输尿管端端吻合术可以节约手术时间，避免输尿管迂曲，但存在对术者手术技艺要求高，术中无法有效检测吻合效果，以及术后会发生显著的慢性输尿管梗阻的缺点。我们综合考虑还是采用了输尿管膀胱瓣吻合术，术后4周，8周，12周病理均显示膀胱瓣血供良好，输尿管蠕动正常，没有梗阻。

3.3细节的改进

3.3.1麻醉麻醉剂量过少，大鼠术中苏醒会导致应激性事件的发生，大大降低其生存率。麻醉剂量过多，则会造成器官低灌注，肾血栓形成，花斑肾。我们采用10%水合氯醛3ml/kg一次性注射，术中按需要于腹腔滴加少量水合氯醛维持麻醉。效果良好，大鼠苏醒时间可控。

3.3.2灌注我们之前采用小儿7号静脉留置针进行腹主动脉插管灌注，操作中发现由于管腔是软质塑料，在灌注过程中极易发生扭曲、弯折导致灌注不进。插管处反流常需要用镊子夹紧，而软质管子更易被夹闭。我们使用自制的插管(1mL注射器针头磨平)具有良好的灌注效果，且管腔不会弯折。

总之，我们采用自制插管肾原位肝素钠生理盐水灌注，大鼠动静脉端端吻合术，连续缝合间断打结法缝合动脉。输尿管膀胱瓣与受体膀胱吻合，术后10d切除对侧肾的方法成功建立了大鼠肾移植模型。我们改进的该模型手术成功率92.1%，8周可见明显慢性排斥反应，且具有手术时间短，操作简便，重复性好等特点，可用于肾移植慢性排斥相关研究。

参考文献：

[1]Fisher B，Lee S.Microvascular surgical techniques in research with special reference to renal transplantation in rat[J].Surgery,1965,58(5):904

[2]White E,Hildemann WH,Mullen Y.Chronic kidney allograft reactions in rats[J].Transplantation,1969,8(5):602

[3]陈金芝,夏穗生.大白鼠异体肾移植术[J].中华器官移植杂志,1981,2(2):73

[4]Shrestha B,Haylor J.Experimental rat models of chronic allograft nephropathy：a review[J].Int Nephrol Renovosc Dis，2014,23(7):315

[5]臧崇森,李祎,傅耀文,等.大鼠原位肾移植模型的建立[J].中国实验诊断学,2009,13(1):40

[6]李建,许亚宏.大鼠肾移植模型四种肾静脉重建术式的比较[J].中华移植杂志,2013,7(4):208

[7]刘皎林,周洪澜,王医术,等.改良的血管端端吻合法建立大鼠原位肾移植模型[J].中国实验诊断学,2012,16(2):229

[8]Daniller A，Buchholz R，Chase RA.Renal transplantation in rats with the use of microsurgical techniques：A new method[J].Surgery，1968，63(6):956

[9]Silber SJ，Crudop J.Kidney transplantation in inbred rats[J].American Journal of Surgery,1973,125(5):551

*通讯作者，E-mail:xianlinxu@126.com

中图分类号：R-332

文献标识码：B

文章编号：2095-4646(2016)03-0197-02

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.03.0197

(收稿日期：2016-02-04)