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重组大肠杆菌全细胞转化马来酸高效合成富马酸

2016-03-07房月芹刘文茂周哲敏

食品与生物技术学报 2016年12期
关键词:苹果酸富马酸

房月芹, 周 丽, 刘文茂, 周哲敏*

(1.江南大学 环境与土木工程学院,江苏 无锡214122;2.江南大学 生物工程学院,江苏 无锡214122)

重组大肠杆菌全细胞转化马来酸高效合成富马酸

房月芹1, 周 丽2, 刘文茂2, 周哲敏*2

(1.江南大学 环境与土木工程学院,江苏 无锡214122;2.江南大学 生物工程学院,江苏 无锡214122)

重组Escherichia coli细胞催化马来酸合成富马酸时,细胞中富马酸酶将产物富马酸转化成苹果酸,转化率达15.5%,降低了富马酸的转化率和纯度。将E.coli BL21(DE3)基因组中fumA-fumC基因敲除,并高效表达马来酸顺反异构酶,重组菌BL21(DE3)△fumA-fumC/ pET24a-maiA经发酵罐培养,可产生64 g/L菌体,马来酸顺反异构酶表达量达306 U/mL。按照60 g/L的发酵液:2 mol/L富马酸为1∶4的体积比配置反应液,37℃反应1 h,富马酸转化率高达98.4%,仅产生0.7%的苹果酸副产物。该结果为全细胞催化法合成富马酸的工业化奠定了基础。关键词:富马酸;马来酸顺反异构酶;全细胞催化;苹果酸

富马酸(Fumaric acid),又称反丁烯二酸、延胡 索酸,是一种天然存在的有机酸。作为一种重要的四碳平台化合物和精细化工产品,富马酸广泛用于食品、医药、化工、涂料、增塑剂等领域[1]。例如,在食品方面,可用作口味纯正的酸味剂、风味增强剂。在医药方面,富马酸铁则广泛应用于医学上治疗人体的小红血球贫血病。

目前,工业上主要以顺丁烯二酸酐为原料通过化学转化的方法生产富马酸[2-3]。然而,化学转化过程需高温条件,化学反应平衡严格限制了转化率,反应过程中形成副产物影响富马酸的产量和产物的质量。以酶作为催化剂生产富马酸,具有反应条件温和、副产物少、特异性强、专一性高和转化率高等优点。马来酸顺反异构酶(EC 5.2.1.1,Maleate cistrans Isomerase,MaiA)属于天冬氨酸、谷氨酸消旋酶超家族[4],能够催化马来酸在碳碳双键不断裂的情况下异构化生成富马酸。其中,粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)来源的马来酸顺反异构酶具有转化率高、pH范围宽泛、Km值较低等特点,是有望用于工业生产富马酸的生物催化剂之一[5]。作者所在实验室前期用Serratia marcescens来源的马来酸顺反异构酶的游离酶转化马来酸合成富马酸,转化率可达99%[6]。进一步使用含有该酶的细胞进行生物催化反应,可避免游离酶提取和纯化成本高、稳定性低、回收利用困难等问题[7]。同时,全细胞催化只需对细胞进行培养就能获得大量的全 细胞 生物催化剂,通过简单的过滤或者离心就能对产品进行分离纯化[8],简化了生物催化剂的制备步骤,在许多工业生物转化过程都得到应用。然而,细胞内同时存在多种酶,全细胞生物转化工程中最严重的问题是会产生副产物[9]。例如用全细胞催化马来酸合成富马酸时,富马酸酶(又名延胡索酸水合酶)的存在导致富马酸被转化成L-苹果酸,降低富马酸的转化率和纯度。Ichikawa等[10]通过加热方法将产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)XD-1中的富马酸酶失活,从而将XD-1全细胞转化合成富 马 酸的转化率由69.8%提高为95%。然而,加热易导致细胞裂解,释放复杂的细胞内含物质,影响产品质量。

作者敲除大肠杆菌BL21(DE3)中的fumA-fumC和fumB基因,减少富马酸到L-苹果酸的代谢通路。以所获得的重组菌株为宿主,表达来源于Serratia marcescens的马来酸顺反异构酶。最终获得的重组细胞可高效转化马来酸底物合成高纯度富马酸,几乎不合成苹果酸副产物,为全细胞法催化马来酸生产富马酸的工业化提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒与引物

菌株E.coli BL21(DE3)/pET-24a(+)-maiA、重组质粒pET-24a(+)-maiA:由作者所在实验室构建和保藏[6];质粒pKD46(温度敏感型,含有阿拉伯糖启动子调控的 gam,bet和 exo基因,Ampr)、pKD13(含有FRT-kan-FRT突变盒,Kanr)、pCP20(温度敏感型,含有FLP重组酶,Ampr):购于耶鲁大学基因保藏中心[11]。

本研究所用引物见表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2 主要试剂与培养基

ExTaq DNA聚合酶:宝生物工程(大连)公司;质粒提取、纯化试剂盒、抗生素:生工生物工程(上海)股份有限公司;马来酸、富马酸及其他试剂:国药化学试剂有限公司产品。

LB培养基成分为(g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10。

摇瓶发酵培养基(g/L):甘油10,胰蛋白胨12,酵母粉 12,MgSO4·7H2O 0.5,K2HPO4·3H2O 16.4,KH2PO4·12H2O 6.1。

发酵罐种子培养基(g/L):LB培养基。

发酵罐发酵培养基(g/L):甘油8,胰蛋白胨2,酵 母 粉 2,C6H8O7·H2O 1.7,MgSO4·7H2O 1.7,(NH4)2HPO44,KH2PO413.5;微量元素液10 mL。

补料培养基(g/L):甘油500,胰蛋白胨4,酵母粉4,MgSO4·7H2O 7.4。

微量元素成分为(g/L):FeSO4·7H2O 10,CuSO4· 5H2O 1,MnSO4· 4H2O 0.5,ZnSO4· 7H2O 2.3,(NH4)MO7O240.1,Na2B4O7·10H2O 0.2,CaCl22,溶于1 mol/L HCl溶液中。

1.3 重组菌株摇瓶发酵培养方法

-80℃冰箱保存的重组菌株在LB固体平板上划线活化,挑取LB平板上单菌落,接种至5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中,37℃、200 r/min振荡培养8 h。上述培养液以1%的接种体积分数转接入30 mL含50 μg/mL卡那霉素的摇瓶发酵培养基,于37℃恒温摇床中200 r/min培养至OD600约为2.2时,加入乳糖至终质量浓度为4 g/L,同时移至20℃恒温摇床中进行诱导表达,200 r/min继续培养20 h。

1.4 重组菌株发酵罐发酵培养方法

1.4.1 种子培养方法 取-80℃冰箱的甘油管保藏物200 μL菌液接种于30 mL含有50 μg/mL卡那青霉素抗性的LB培养基中,置于37℃的恒温摇床中200 r/min培养7.5 h。

1.4.2 发酵罐培养方法 5 L发酵罐 (Winpact FS-02,Major Science,Saratoga,CA,USA)初始装液量为2 L。培养温度设定为37℃,初始转速200 r/min,通气量为5 L/min,设定此时罐内初始溶解氧(DO)100%。将种子培养液以7%的接种体积分数接入发酵罐中,同时加入终质量浓度为50 μg/mL的卡那青霉素,将发酵罐的溶氧与转速相偶联,维持罐内溶氧浓度在30%。接种约5~6 h后出现溶氧反弹现象,此时以指数流加补料策略补加补料培养基,控制菌体比生长速率(μ)为0.25(h-1)。当OD600达到60时,改变温度为30℃,并以0.22 g/(L·h)的恒流速流加乳糖进行诱导。整个发酵用体积分数25%的氨水维持pH在7.2。

1.4.3 指数补料控制策略 发酵罐培养过程中,以甘油为限制性底物,根据以下公式[12]进行指数补料,控制恒定的比生长速率:

其中,F(t)是补料速率(L/h);X0和V0分别是分批补料初始阶段的细胞干重(g/L)和培养基体积(L);μset是设定的比生长速率(h-1);t为流加时间(h);Yx/s是细胞对底物的得率系数(g/g),其经验值为0.46 g/g;Sf和S0分别是补料培养基和分批发酵结束后发酵罐中的甘油质量浓度(g/L)。实验中补料速率(F)每2小时改变一次。

1.5 分析方法

1.5.1 菌体量测定方法 菌体密度采用浊度法间接测量,通过OD600来表示,并换算为菌体干重(DCW)。取不同浓度的菌液,8 000 r/min离心10 min去上清液,用去离子水洗涤3次,将菌体放于-80℃预冷冻24 h,用冷冻干燥机处理72 h,将干燥后菌体质量与对应的细胞密度绘制曲线,得到菌体干重(DCW)和OD600的关系:1 OD600=0.408 3 g/L DCW。

1.5.2 全细胞马来酸顺反异构酶酶活测定方法

1)细胞预处理方法:离心收集发酵液中的菌体,用pH 8的66.7 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4缓冲液洗涤1次。

2)粗酶液制备方法:菌体洗涤后,用超声波破碎细胞,12 000 r/min离心10 min,上清液即为粗酶液。取100 μL适度稀释的菌液或粗酶液,加入50 μL 1 mol/L的马来酸溶液,用 50 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4缓冲液将反应体系补充到500μL,于指定温度下保温10 min。100℃煮沸10 min,离心,取上清液稀释50倍,测定生成的富马酸含量。

酶活力单位定义:在上述反应条件下,每分钟转化生成1 μmol富马酸产物所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

相对酶活计算公式为:

其中,Yrel是相对酶活 (%);Y是本样品的酶活(U);Ymax是本次实验所有样品中最高的酶活(U)。

1.5.3 马来酸、富马酸和苹果酸的测定方法 马来酸、富马酸和苹果酸浓度用高效液相色谱(HPLC)法测定。HPLC检测条件:色谱柱Prevail Organic Acid(250 mm×4.6 mm,5 μm;Grace Davison Discovery Sciences),流动相为pH 2.5的25 mmol/L K2HPO4溶液,流速1 mL/min,柱温40℃,紫外检测器波长210 nm,进样量10 μL。

2 结果与讨论

2.1 BL21(DE3)/pET24a-maiA全细胞转化马来酸合成富马酸

按照BL21(DE3)/pET24a-maiA发酵液:2 mol/L富马酸为1∶4的体积比配置反应液,在40℃下反应3 h。由图1可见,BL21(DE3)/pET24a-maiA全细胞反应过程中,底物马来酸主要转化为富马酸,并积累苹果酸副产物,导致目的产物富马酸的转化率和纯度降低,不利于产品的应用。

图1 BL21(DE3)/pET24a-maiA全细胞转化马来酸合成富马酸过程Fig.1 Biosynthetic process of fumarate from malaete by BL21(DE3)/pET24a-maiA cell

2.2 BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24a-maiA和BL21(DE3)△fumB/pET24a-maiA菌株的构建

E.coli的TCA循环中具有富马酸酶,能够催化富马酸水合生成L-苹果酸。富马酸酶有3个同工酶[13],分别是FumA、FumB、FumC,其中FumA在有氧条件下参与TCA循环的运行[14];FumB在厌氧条件下有功能[15];FumC是酶学性质和FumA类似的备用酶,并且在胁迫环境中可以代替FumA行使功能[14]。因此,为了保证富马酸产物的高效合成,降低副产物的积累,作者进一步将富马酸酶的编码基因敲除。fumA和fumC基因在基因组中位于相邻的位置,所以将这两个基因同时敲除,保留fumB基因;或者保留fumA和fumC基因,敲除fumB基因,以维持菌体生长。

用Datsenko等[11]报道的基因删除方法,分别将BL21(DE3)染色体上的fumA-fumC和fumB基因删除。其具体过程为:以pKD13质粒为模板,分别用FumC-pKD13F/FumA-pKD13R引物和 FumB-pKD13F/FumB-pKD13R引物进行PCR扩增,得到两端为同源臂、中间为FRT-kan-FRT基因片段的线性同源重组片段(大小为1 303 bp)。将同源重组片段分别电转入含有pKD46质粒的BL21(DE3)菌株中,借助pKD46质粒上的Red重组系统将同源重组片段整合于染色体上,在卡那霉素抗性平板上筛选转化子。重组菌株PCR验证结果见图2。出发菌株BL21(DE3)、转化子BL21(DE3)fumA-fumC::FRTKm分别用YfumCF/YfumAR引物PCR扩增,其电泳条带分别为3 526 bp和2 036 bp;BL21(DE3)和 BL21(DE3)fumB::FRTKm分别用 YfumBF/ YfumBR引物PCR扩增,其电泳条带分别为1 660 bp和1 716 bp,表明fumA-fumC和fumB基因成功被FRT-kan-FRT片段替换。最后用pCP20质粒去除重组菌中的卡那霉素抗性基因,转化子BL21(DE3)fumA-fumC::FRT和BL21(DE3)fumB::FRT分别用YfumCF/YfumAR引物和YfumBF/YfumBR引物PCR扩增,其电泳条带为438 bp和494 bp,表明fumA-fumC和fumB基因已经被成功敲除。所获得的重组菌株分别命名为BL21(DE3)△fumA-fumC和BL21(DE3)△fumB。

进一步将pET24a-maiA质粒分别转化到BL21(DE3)△fumA-fumC和 BL21(DE3)△fumB菌株中,分别获得BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24amaiA和BL21(DE3)△fumB/pET24a-maiA菌株。

2.3 fumA-fumC和fumB基因删除对全细胞催化过程中苹果酸积累量的影响

收集BL21(DE3)/pET24a-maiA、BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24a-maiA和BL21(DE3)△fumB/ pET24a-maiA菌体,并用 pH 8的 66.7 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4缓冲液重悬至OD600=10。取菌液各1 mL,加入4 mL 500 mmol/L的马来酸溶液中,在40℃、pH 8条件下反应10 min。如表2所示,菌株BL21(DE3)△fumB/pET24a-maiA的反应液中,苹果酸副产物的积累量与出发菌株相似,而菌株BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24a-maiA仅产生了少量的苹果酸副产物。因此,fumA-fumC基因是全细胞催化反应过程中苹果酸合成的主要途径,BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24a-maiA菌株更适合应用于全细胞催化马来酸合成富马酸。

图2 基因敲除菌株PCR验证电泳图Fig.2 PCR identification of the deletion strains

表2 苹果酸副产物积累量的比较Table 2 Comparison of malate byproduct

2.4 菌株 BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24amaiA发酵罐发酵性能

进一步将BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24amaiA菌株在5 L罐发酵中培养,考察其菌体生长与马来酸顺反异构酶合成性能。由图3可知,发酵培养最高可获得干重达64 g/L的菌体细胞,最高酶活可达306 U/mL。表明基因敲除后仍可实现菌体和马来酸顺反异构酶的高效合成,显示出大规模应用的潜力。

2.5 BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24a-maiA菌全细胞催化的最适温度和pH优化

BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24a-maiA的菌体分别在pH 8、不同温度下以100 mmol/L马来酸为底物催化10 min,测定相对酶活。细胞催化马来酸合成富马酸的活性随温度升高而升高,当温度升高到50℃时达到最大催化能力,之后随温度升高酶活很快下降,见图4(a)。

BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24a-maiA菌体分别在50℃、不同pH下测定相对酶活。由图4(b)可知,溶液pH对全细胞催化活性影响不大,在pH 8.3时获得最高酶活。这可能是因为外界pH的改变对胞内环境影响较小,导致细胞对马来酸催化活性不受显著影响。

图3 菌株BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24a-maiA 5 L发酵罐发酵菌体生长及产酶曲线Fig.3 Growth and enzyme production status of BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24a-maiA in5L bioreactor

图4 BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24a-maiA全细胞催化最适温度和pHFig.4 Optimum temperature and pH of BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24a-maiA

2.6 BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24a-maiA全细胞催化的稳定性

如果将全细胞应用于工业化富马酸的生产,为产品纯度和提纯工艺考虑,菌液添加量不宜过大,底物浓度应尽量增大,这就需要延长细胞催化时间。而大肠杆菌细胞在高温条件下易裂解,因此对细胞的温度稳定性进行考察。由图5可以看出,在大肠杆菌最适生长温度37℃下保温10 h后,细胞依然保留75%的初始酶活性;而在细胞最适催化温度50℃下保温3 h后,细胞仅具有25%的初始酶活性,所以37℃更适宜工业化的长时间催化。此外,细胞在37℃时的催化活性可达50℃下的90%,并且比50℃高温条件的能耗低,因此,37℃下进行全细胞反应更为适宜。

图5 BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24a-maiA细胞在37℃和50℃下稳定性比较Fig.5 Stability of BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24amaiA at 37℃and 50℃

2.7 BL21△fumA-fumC/pET24a-maiA全细胞催化马来酸生产富马酸的性能

重组菌株经5 L罐发酵培养,按照发酵液(菌体细胞干重为60 g/L)∶2 mol/L富马酸体积比为1∶4配置反应液,在37℃下催化1 h。由表3可见,原始菌株苹果酸副产物积累量达0.25 mol/L,仅产生1.34 mol/L的富马酸,富马酸摩尔转化率仅为84%;BL21△fumA-fumC/pET24a-maiA则仅生成0.011 mol/L的苹果酸,富马酸的合成量提高为1.57 mol/L,富马酸转化率提高为98.4%,高于Ichikawa等[10]用产碱假单胞菌 (Pseudomonas alcaligenes)XD-1进行全细胞催化的结果(富马酸产量为0.49 mol/L,富马酸对马来酸的转化率95%)。

表3 细胞催化马来酸合成富马酸性能比较Table 3 Comparison of whole-cell biocatalysis of fumarate from maleate

3 结语

作者用Red重组方法对E.coli BL21(DE3)进行改造,分别敲除基因组中的fumA-fumC以及fumB基因,表明fumA-fumC基因编码的代谢途径是全细胞催化马来酸合成富马酸过程中副产物苹果酸合成的主要途径。重组菌株 BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24a-maiA经发酵罐培养可实现菌体(64 g/L)和马来酸顺反异构酶的高效合成(306 U/mL)。该发酵液可将1.6 mol/L的马来酸转化为1.57 mol/L富马酸,富马酸转化率提高到98.4%,而苹果酸的转化率仅为0.7%,显示出较好的工业应用潜力。

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Efficient Production of Fumarate from Maleate Using Recombinant E.coli as Whole Cell Biocatalyst

FANG Yueqin1, ZHOU Li2, LIU Wenmao2, ZHOU Zhemin*2
(1.School of Environment and Civil Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Fumarate could be produced from maleate with whole cell of recombinant Escherichia coli.However,malate,with a yield of 15.5%,was generated as byproduct by the cellular fumarase,resulting in a decreased fumarate yield and purity.The chromosomal genes,fumA and fumC,in E. coli BL21(DE3)were inactivated,followed by over expression of the maleate cis-trans isomerate. After cultured in a bioreactor,the resulting strain BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24a-maiA could generate 64 g/L dry cell weight and maleate cis-trans isomerate of 306 U/mL.With a volumetric ratio of fermentation broth(60 g/L dry cell weight):fumarate(2 mol/L)=1∶4,fumarate yield of 98.4%and malate yield of 0.7%were produced after incubation at 37℃for 1 h.These results laid a foundation for industrial production of fumarate by whole-cell biocatalyst.

fumarate,maleate cis-trans isomerate,whole-cell biocatalysis,malate

Q 815

A

1673—1689(2016)12—1323—07

2015-07-08

江苏省自然科学基金项目(BK20130131,BK20130139);江苏省产学研联合创新资金——前瞻性联合研究项目(BY2014023-21)。

房月芹(1969—),女,安徽砀山人,理学硕士,讲师,主要从事微生物方面的研究。E-mail:yqfang2003@hotmail.com

*通信作者:周哲敏(1969—),男,河北石家庄人,理学博士,教授,博士研究生导师,主要从事发酵工程方面的研究。

E-mail:zhmzhou@jiangnan.edu.cn

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