MIF抑制剂ISO-1在妊娠大鼠重症急性胰腺炎肺损伤中的作用

李晨，王卫星，左腾，石乔，王鹏，赵亮，梅方超

(武汉大学人民医院肝胆腔镜外科，湖北武汉430060)

MIF抑制剂ISO-1在妊娠大鼠重症急性胰腺炎肺损伤中的作用

李晨，王卫星，左腾，石乔，王鹏，赵亮，梅方超

(武汉大学人民医院肝胆腔镜外科，湖北武汉430060)

目的探讨巨噬细胞移动抑制因子(MIF)在孕鼠重症急性胰腺炎(SAP)肺损伤中的作用。方法30只晚期SD孕鼠使用随机数字表法随机分为孕鼠组(SO组)、孕鼠SAP组(SAP组)和孕鼠MIF抑制剂ISO-1预处理组(ISO-1组)，每组均为10只。逆行胆胰管注射5%牛磺胆酸钠制备SAP模型。术后12 h处死大鼠取血检测血清淀粉酶(AMY)。取胰腺组织及肺组织行病理学检查并评分，免疫组化检测肺组织中MIF、核因子κB(NF-κB)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达。结果SAP组孕鼠的血清淀粉酶(AMY)、胰腺及肺组织病理评分较SO组均有显著增高，差异有统计学意义(P＜0.05)；SAP组孕鼠肺组织中的MIF、NF-κB及TNF-α表达较SO组也显著增强，差异有统计学意义(P＜0.05)。ISO-1组上述指标较SAP组均有显著改善，差异有统计学意义(P＜0.05)。MIF的表达与NF-κB及TNF-α的表达均呈正相关，相关系数分别为r=0.815和r=0.787，P＜0.05。结论MIF抑制剂ISO-1对孕鼠急性重症胰腺炎肺损伤具有一定的保护作用，其部分机制可能与抑制NF-κB及TNF-α的激活有关。

妊娠合并急性胰腺炎；肺损伤；巨噬细胞移动抑制因子；核因子-κB；肿瘤坏死因子-α

妊娠合并急性胰腺炎(Acute pancreatitis in pregnancy，APIP)是妊娠合并外科急腹症的首位病死原因[1]，发病率为1/3 000～1/1 000[2]，具有起病急、发展快、易出现多脏器功能衰竭和病死率高的特点。有报道APIP并发肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)及多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)在APIP中的发生率高达60%[3]。目前关于APIP的实验研究较少，本研究旨在探讨巨噬细胞移动抑制因子(MIF)在孕鼠重症急性胰腺炎(SAP)肺损伤发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组妊娠晚期SD大鼠30只，孕期16～17 d，体重330～380 g，由武汉大学动物实验中心提供。使用随机数字表法随机分为三组：孕鼠组(SO组)，孕鼠SAP组(SAP组)，孕鼠MIF抑制剂ISO-1预处理组(ISO-1组)，每组均为10只。

1.2 主要试剂牛磺胆酸钠购自美国Sigma公司，MIF抑制剂ISO-1购自美国Santa Cruz公司，MIF抗体、TNF-α抗体购自美国Abcam公司，NF-κB抗体购自美国CST公司。

1.3 动物模型制作与处理实验前大鼠禁食12 h，自由饮水。麻醉动物取仰卧位，碘伏棉球消毒腹部后铺洞巾，无菌操作下上腹正中切口入腹，肝门处分离出胆总管后，以无损伤血管夹夹闭。使用4.5#注射针头穿十二指肠壁，经十二指肠大乳头逆行穿刺进入胆胰管，以无损血管钳夹闭近乳头处的胆胰管与穿刺针。以微量注射泵向胆胰管恒速(0.1 ml/min)注入5%牛磺胆酸钠(1 ml/kg)。注射完毕后，抽出针头的同时原位夹闭胆胰管5 min，确认周围胰腺组织立即出现水肿、出血、坏死后松开无损伤血管夹，逐层缝合关闭腹腔，SAP造模完毕。SO组孕鼠开腹后仅翻动十二指肠和胰腺后关腹。SO组及SAP组术前30 min经腹腔注射5%DMSO(2 ml/kg)，ISO-1组术前30 min腹腔注射溶解ISO-1(7.0 mg/kg)的5%DMSO(2 ml/kg)溶液。大鼠苏醒后禁食不禁水，分笼喂养。

1.4 标本获取各组大鼠依照时间于术后12 h处死，下腔静脉穿刺取血，2 000 r/min离心血清15 min后冻存备用。取适量胰头、右肺上叶组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，取部分肺组织-80℃保存备用。

1.5 指标检测

1.5.1 生化指标检测采用全自动多功能生化分析仪检测大鼠血清淀粉酶(AMY)水平(武汉大学人民医院检验科)。

1.5.2 HE染色观察胰腺及肺组织病理变化将胰腺及肺组织固定包埋后切片，HE染色并进行光镜观察。胰腺病理评分参照文献[3]，根据胰腺是否出现水肿、坏死、出血和脂肪坏死、炎症和血管炎性细胞浸润进行病理学评分。肺损伤组织学评分参照文献[4]，根据肺泡壁水肿程度、中性粒细胞和单核细胞的浸润程度以及间质和肺泡腔出血范围来判断肺损伤的程度。

1.5.3 免疫组织化学染色各组取肺组织切片，脱蜡水化后行抗原修复，阻断内源性过氧化氢酶，一抗二抗孵育、链霉素抗生物素-过氧化物酶依次孵育后，DAB显色。观察MIF、NF-κB及TNF-α表达，并使用Image pro-Plus6.0软件进行累计光密度(IOD)值测量，进行表达半定量分析。

2 结果

2.1 胰腺生化及病理学检查SAP组大鼠血清AMY水平较SO组显著升高。ISO-1组AMY水平与SO组相比升高明显(P＜0.05)，但与SAP组相比较，淀粉酶水平明显降低，差异有统计意义(P＜0.05)。胰腺病理观察，SO组胰腺小叶结构完整，无明显病理改变或仅见轻度水肿。SAP组胰腺切片可见胰腺不同程度的水肿、出血及片状坏死，腺叶间隙增宽和炎性细胞浸润，病理评分较SO组显著增加(P＜0.05)；ISO-1组胰腺腺泡轻度水肿，间质内有少量出血及炎性细胞浸润，病理评分较SAP组大鼠显著降低(P＜0.05)，见表1。

2.2 肺组织病理改变与评分SO组肺组织结构清晰，肺泡壁完整，肺间质无渗出。SAP组肺间隔增宽，大量炎症细胞浸润，肺泡腔内大量渗出物，肺泡腔塌陷，局灶性实变，病理评分较SO组大鼠显著升高(P＜0.05)。ISO-1组肺间质增宽，充血水肿，有少量炎性细胞浸润，病理评分较SAP组大鼠显著降低(P＜0.05)，见表1及图1。

注：与SO组比较，aP＜0.05；与SAP组比较，bP＜0.05。

2.3 免疫组织化学检查肺组织中MIF、NF-κB及TNF-α表达采用免疫组织化学染色法染色，SAP组孕鼠肺组织中MIF、NF-κB及TNF-α的表达明显增加，IOD值较SO组显著升高；ISO-1组孕鼠肺组织中MIF、NF-κB及TNF-α的表达显著少于SAP组，IOD值显著降低；各组间差异有统计学意义(P＜0.05)，见图2、图3、图4。

图1 各组大鼠肺组织病理改变(HE×200)

图2 各组大鼠肺组织中MIF的表达(×200)注：A：SO组；B：SAP组；C：ISO-1组；D：MIF IOD值。

图3 各组大鼠肺组织中NF-κB的表达(×200)注：A：SO组；B：SAP组；C：ISO-1组；B：NF-κB IOD值。

图4 各组大鼠肺组织中TNF-α的表达(×200)注：A：SO组；B：SAP组；C：ISO-1组；D：TNF-α IOD值。

2.4 相关性分析各组孕鼠肺组织中MIF的表达与NF-κB的表达呈正相关，相关系数为r=0.815，P值小于0.01；各组孕鼠肺组织中MIF的表达与TNF-α的表达呈正相关，相关系数为r=0.787，P＜0.05。

3 讨论

近年来，随着生活水平的提高和饮食结构的改变，APIP的发病率有升高的趋势，其不仅影响妊娠进展及胎儿成长，还极易伴发全身炎症反应综合征(SIRS)、ARDS、MODS，增加母婴围产期的死亡率[5]。因此笔者研究MIF在APIP肺损伤中的作用对于保护APIP母婴在围产期的安全具有重要意义。

本实验结果显示，SAP组孕鼠血清AMY水平及胰腺、肺组织病理学评分较SO组显著升高，提示APIP合并肺损伤模型建立成功，APIP中胰腺和肺损伤程度呈正相关；免疫组化结果显示SAP组孕鼠肺组织中MIF、NF-κB及TNF-α的表达较SO组显著升高，提示APIP发病过程中肺组织中MIF及炎症因子表达增加，与肺损伤程度密切相关。

近年来，MIF已被证实在SAP[6-7]、ARDS[8-9]及脓毒症休克等危重疾病的致病机制中起着关键作用。MIF是集细胞因子、趋化因子、神经-内分泌激素和生物酶特性于一身的多效能蛋白分子，可抑制巨噬细胞的游走，促进巨噬细胞在炎症局部浸润、增生、分泌一些细胞因子，如IL-1 β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ等[10]。TNF-α是SAP中的一个最早升高并起核心作用的促炎因子，Calandra等[11]报道TNF-α会反过来促进巨噬细胞分泌MIF，TNF-α和MIF协同作用于前炎症反应环路，导致SAP病情的加重。NF-κB是一类能与多种细胞基因的启动子或增强子κB位点发生特异性结合并启动基因转录的蛋白质，在调控多种炎性细胞因子的表达上起着关键作用。APIP合并肺损伤时，肺组织NF-κB的激活可引起多种促炎蛋白表达，包括细胞因子(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α等)和黏附分子(ICAM-1、P-selectin)等，从而导致肺损伤。Daun等[12]研究发现，MIF可以通过抑制糖皮质激素对IκB-α表达的上调，对抗激素在NF-kB/IκB-α信号转换通路中的效应，进而阻断其对炎症因子表达的限制作用，说明MIF可对NF-κB的激活进行调控。

笔者在实验中应用选择性MIF互变异构酶活性抑制剂ISO-1，观察其对APIP肺损伤的作用。实验结果表明，ISO-1组孕鼠血清淀粉酶水平下降，胰腺、肺组织病理改变减轻，肺组织中MIF、NF-κB及TNF-α的表达水平下降。说明ISO-1对APIP孕鼠肺损伤具有一定的保护作用，其部分机制可能与抑制NF-κB及TNF-α的激活有关。

[1]Scherer J,Singh VP,Pitchumoni CS,et al.Issues in hypertriglyceridemic pancreatitis:an update[J].J Clin Gastroenterol,2014,48(3): 195-203.

[2]Pandey R,Jacob A,Brooks H.Acute pancreatitis in pregnancy:review of three cases and anaesthetic management[J].Int J Obstet Anesth,2012,21(4):360-363.

[3]蒋晓忠,严律南,龚光,等.妊娠合并急性胰腺炎的临床诊治分析[J].中华肝胆外科杂志,2008,14(11):759-762.

[4]Schmidt J,Rattner DW,Lewandrowski K,et al.Abetter model of acute pancreatitis for evaluating therapy[J].Ann Surg,1992,215(1):44-56.

[5]程石,何三光,张佳林.肺泡巨噬细胞活化在急性坏死性胰腺炎大鼠肺损伤中的作用[J].中华外科杂志,2002,40(8):609-612.

[6]Tang SJ,Rodriguez-Frias E,Singh S,et al.Acute pancreatitis during pregnancy[J].Clin Gastroenterol Hepatol,2010,8(1):85-90.

[7]Rahman SH,Menon KV,Holmfield JH,et al.Serum macrophage migration inhibitory factor is an early marker of pancreatic necrosis in acute pancreatitis[J].Ann Surg,2007,245(2):282-289.

[8]Matsuda N,Nishihira J,Takahashi Y,et al.Role of macrophage migration inhibitory factor in acute lung injury in mice with acute pancreatitis complicated by endotoxemia[J].Am J Respir Cell Mol Biol, 2006,35(2):198-205.

[9]Lai KN,Leung JC,Metz CN,et al.Role for macrophage migration inhibitory factor in acute respiratory distress syndrome[J].J Pathol, 2003,199(4):496-508.

[10]Donnelly SC,Haslett C,Reid P T,et al.Regulatory role for macrophage migration inhibitory factor in acute respiratory distress syndrome[J].Nat Med,1997,3(3):320-323.

[11]Calandra T,Roger T.Macrophage migration inhibitory factor:a regulator of innate immunity[J].Nat Rev Immunol,2003,3(10):791-800.

[12]Bernhagen J,Mitchell RA,Calandra T,et al.Purification,bioactivity, and secondary structure analysis of mouse and human macrophage migration inhibitory factor(MIF)[J].Biochemistry,1994,33(47): 14144-14155.

[13]Daun JM,Cannon JG.Macrophage migration inhibitory factor antagonizes hydrocortisone-induced increases in cytosolic IkappaBalpha [J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2000,279(3): R1043-R1049.

Effects of MIF inhibitor ISO-1 on lung injury in rat models of acute pancreatitis in pregnancy.

LI Chen,WANG Wei-xing,ZUO Teng,SHI Qiao,WANG Peng,ZHAO Liang,MEI Fang-chao.Department of Hepatobiliary Surgery, People's Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo explore the effects of ISO-1(macrophage migration inhibitory factor,MIF)on lung injury in pregnant rats with severe acute pancreatitis(SAP).MethodsThirty pregnant SD rats were randomly divided into the sham operation(SO)group,SAP group,and ISO-1 group,with 10 rats in each group.SAP model was established by retrograde injection of 5%sodium taurocholate into the biliopancreatic duct.The level of serum amylase and histopathological scores of pancreatic and lung tissues were determined.MIF,NF-κB and TNF-α activity in the lung was examined by immunohistochemical methods.ResultsSerum level of amylase(AMY),histopathological scores of pancreatic and lung tissues and activities of MIF,NF-κB,TNF-α in SAP group increased significantly as compared with those in SO group(P＜0.05),and the microscopic lung injuries were gradually aggravated with disease progression(P＜0.05).In ISO-1 group,all the above mentioned indexes were reduced significantly in comparison with those in the SAP group(P＜0.05).Intrapulmonary levels of MIF was positively associated with the expression of NF-κB and TNF-α(r= 0.815,r=0.787,P＜0.05).ConclusionMIF inhibitor ISO-1 protects lung from injury in pregnant rats with SAP.It was suggested that MIF was one of the mechanisms in acute pancreatitis in pregnancy with lung injury and may correlate with the activations of NF-κB and TNF-α.

Acute pancreatitis in pregnancy;Lung injury;Macrophage migration inhibitory factor(MIF);Nuclear factor-κB(NF-κB);Tumor necrosis factor-α(TNF-α)

R-332

A

1003—6350（2016）02—0180—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.02.003

2015-10-18)

国家自然科学基金（编号：81370562）；湖北省卫生厅科研基金重点资助项目（编号：JX6A07）；天晴肝病扶持基金（编号：TQCB20140182）

王卫星。E-mail:sate.llite@163.com