果王素对肺癌GP方案化疗骨髓抑制小鼠的保护作用

贺兼斌，易高众，向志，唐建新，邓湘，张平

(1.湖南医药学院附属怀化市第一人民医院呼吸内科，湖南怀化418000；2.南华大学附属第一医院呼吸内科，湖南衡阳421001)

果王素对肺癌GP方案化疗骨髓抑制小鼠的保护作用

贺兼斌1，易高众1，向志1，唐建新1，邓湘2，张平1

(1.湖南医药学院附属怀化市第一人民医院呼吸内科，湖南怀化418000；2.南华大学附属第一医院呼吸内科，湖南衡阳421001)

目的观察果王素对肺腺癌小鼠使用GP方案化疗过程中对骨髓抑制的保护作用，初步探讨果王素防治骨髓抑制的机制。方法32只接种Lewis肺癌的C57BL/6J小鼠随机分成对照组、化疗组(GP方案)、低剂量果王素联合化疗组及高剂量果王素联合化疗组。每组8只，接种Lewis肺癌第四天开始予以相应药物干预，于接种后24 d处死各组小鼠，经眼球静脉丛取各组小鼠血液样本2 ml，行血常规检测,酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)及白介素-2(IL-2)的浓度，取股骨计数骨髓有核细胞数，并测定超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶(MPO)、总抗氧化能力(T-AOC)的含量，取胸腺称重，计算胸腺指数。结果四组小鼠的RBC计数组间两两比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；低剂量果王素联合化疗组、高剂量果王素联合化疗组与化疗组、对照组比较在WBC、血单核细胞(BMNC)、胸腺指数、SOD、T-AOC方面差异均有统计学意义(P＜0.05)，低剂量果王素联合化疗组、高剂量果王素联合化疗组与化疗组比较WBC、PLT、BMNC、胸腺指数、SOD、T-AOC、IL-2明显升高(P＜0.05)，低剂量果王素联合化疗组、高剂量果王素联合化疗组与化疗组比较MPO、MCP-1明显下降，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论果王素能明显减轻化疗中骨髓抑制的程度，其可能机制与增强免疫、清除氧自由基、抑制氧化应激及抑制炎症反应有关。

果王素；α亚麻酸；化疗；骨髓抑制；氧化应激；炎症反应

化疗是肺癌治疗的重要措施，但化疗药物对癌细胞的选择性较差，化疗在杀伤癌细胞的同时，对正常组织细胞如骨髓、肝、肾等也有不同程度的损伤，导致骨髓抑制、肝肾功能损害，在多种副作用中，骨髓抑制是较常见的副反应，严重的骨髓抑制可导致白细胞和血小板显著减少，并发严重感染和出血而危及生命。化疗药物的毒副作用给医师带来极大的困扰，给患者带来痛苦，影响其生活质量，甚至有患者不能耐受毒副作用而中断治疗，可见化疗药物的毒副作用已成为化疗实施的主要障碍。肺癌的化疗以铂类药物为一线药物，尽管铂制剂对肺癌有效，但不良反应亦很明显，其中骨髓抑制限制了该类药物的使用。顺铂联合吉西他滨为GP方案，是肺癌化疗的常用方案，两药联用，骨髓抑制的风险增加。本研究旨在观察果王素对肺癌GP方案化疗骨髓抑制小鼠的保护作用，并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、细胞株、药品及试剂32只雄性C57BL/6J小鼠[许可证号：SCXK11-00-0005，体重(20±2)g]，购自中国医学科学院肿瘤医院实验动物中心，由南华大学肿瘤研究所提供SPF级饲养环境。Lewis肺癌(鼠源)购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，顺铂(生产批号：040605)购于江苏豪森药业股份有限公司，健择(注射用盐酸吉西他滨，规格0.2 g/瓶，批号：A570546A)由法国礼来有限公司(LILLY FRANCE)生产，果王素(浓度60%)由湖南湘西老爹生物有限公司惠赠。超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶(MPO)、总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒由南京建成生物工程研究所提供(批号：20090311)。小鼠IL-2酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒为美国Bio Sources公司产品；小鼠血清单核细胞趋化蛋白1(Monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)ELISA试剂盒购自武汉博士德公司。

1.2 动物模型的建立处死两只接种Lewis肺癌(鼠源)细胞的荷瘤种鼠，按照参考文献[1]的方法建立动物模型。

1.3 分组及用药各小鼠肿瘤接种成功，在皮下移植处形成结节状肿瘤，接种后第4天随机分为四组，每组8只，开始药物干预。对照组：0.9%氯化钠0.4 ml/(鼠·次)于第5、12、19天腹腔各注射一次，蒸馏水0.3 ml/(鼠·次)每日灌胃一次；化疗组：接种4 d后开始腹腔注射药物，按GP方案，顺铂于接种后第5、12、19天腹腔各注射一次，剂量为3 mg/kg，体积为0.2 ml/(鼠·次)，吉西他滨于接种后第5、12、19天腹腔各注射一次，剂量为50 mg/(kg·次)，体积为0.2 ml/(鼠·次)；低剂量果王素联合化疗组：化疗方案同化疗组，于接种后每天灌胃果王素一次，剂量为60 mg/(kg·次)，体积为0.3 ml/(鼠·次)；高剂量果王素联合化疗组：化疗方案同化疗组，于接种后每天灌胃果王素一次，剂量为180 mg/(kg·次)，体积为0.3 ml/(鼠·次)。肿瘤接种24 d后处死全部小鼠。

1.4 观察指标及测定方法

1.4.1 外周血细胞测定小鼠眼球后静脉丛取血，乙二胺四乙酸二钾(EDTA-2K)抗凝，用CA500动物血液细胞分析仪(日本CIS公司产品)计数白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)。

1.4.2 骨髓有核细胞测定处死小鼠，取右侧股骨，用RPMI-1640培养液5 ml冲出全部骨髓，制成单细胞悬液，用3%冰醋酸裂解红细胞，低倍(10×10倍)显微镜下计数，所得数据乘以2.5×104即为1根股骨的骨髓有核细胞数。

1.4.3 胸腺指数测定取胸腺，用滤纸吸干血迹后称重，按胸腺指数=胸腺重量(mg)/体重(g)公式计算胸腺指数。

1.4.4 骨髓中氧化酶及抗氧化酶活性测定制备10%的骨髓组织匀浆，按照试剂盒说明书测定骨髓组织匀浆中SOD、MPO、T-AOC。

1.4.5 血浆中MCP-1及IL-2测定经眼眶采血，留取血清置-80℃冰箱冻存。采用ELISA测定血清中MCP-1及IL-2的含量，酶联仪测定450 nm吸光度值，与标准曲线对比，计算MCP-1及IL-2浓度(ng/ml)。

1.5 统计学方法应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差±s)表示，两组间比较采用组间t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血常规结果化疗对小鼠外周血细胞造成一定损害，与对照组比较，化疗组血常规指标包括WBC、PLT明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；在化疗的同时，予以果王素干预，其外周血细胞减少明显减轻，且与果王素呈剂量相关性，高剂量果王素有更明显的减轻外周血细胞减少作用，见表1。

表1 各组小鼠血常规测定结果比较(±s)

表1 各组小鼠血常规测定结果比较(±s)

注：与对照组比较，aP＜0.01；与化疗组比较，bP＜0.01。

组别PLT(1012/L) RBC(109/L)WBC(109/L)对照组(n=8)化疗组(n=8)低剂量果王素联合化疗组(n=8)高剂量果王素联合化疗组(n=8) 819.43±137.52 431.16±98.43a715.19±103.62ab747.27±112.86b9.15±0.69 8.77±0.52 9.11±0.53 9.02±0.61 7.13±1.32 1.94±0.53a2.57±0.98ab4.65±1.31ab

2.2 骨髓有核细胞和胸腺指数化疗对小鼠造血功能造成一定损害，与对照组比较，化疗组骨髓有核细胞明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；在化疗的同时，予以果王素干预，其造血功能损害明显减轻，且与果王素呈剂量相关性，高剂量果王素有更明显的减轻造血功能损作用，胸腺指数变化与骨髓有核细胞类似，见表2。

表2 各组小鼠骨髓有核细胞和胸腺指数比较(±s)

表2 各组小鼠骨髓有核细胞和胸腺指数比较(±s)

注：与对照组比较，aP＜0.01；与化疗组比较，bP＜0.01。

组别对照组(n=8)化疗组(n=8)低剂量果王素联合化疗组(n=8)高剂量果王素联合化疗组(n=8) BMNC(106/股骨) 4.41±0.89 1.33±0.17a2.31±0.21ab2.46±0.22ab胸腺指数2.26±0.41 0.94±0.27a1.35±0.28ab1.57±0.33ab

2.3 骨髓组织匀浆中氧化及抗氧化酶活性比较化疗使小鼠骨髓组织内MPO含量急剧上升，氧化活性增加，SOD及T-AOC下降，抗氧化活性降低，予以果王素干预，MPO含量呈下降趋势，SOD及T-AOC呈上升趋势，果王素干预的两组MPO、SOD及T-AOC含量与化疗组比较差异均有显著统计学意义(P＜0.01)，见表3。

表3 骨髓组织匀浆中氧化酶及抗氧化酶活性比较(±s)

表3 骨髓组织匀浆中氧化酶及抗氧化酶活性比较(±s)

注：与对照组比较，aP＜0.01；与化疗组比较，bP＜0.01。

组别SOD (µ/mg·port) MPO (µ/mg·port) T-AOC (µ/mg·port)对照组(n=8)化疗组(n=8)低剂量果王素联合化疗组(n=8)高剂量果王素联合化疗组(n=8) 3.93±0.48 1.68±0.65a2.55±0.64ab3.21±0.60ab1.24±0.15 3.51±0.23a2.17±0.16ab1.56±0.09b1.74±0.28 0.91±0.22a1.18±0.24ab1.56±0.27ab

2.4 血浆中MCP-1和IL-2比较与对照组比较，化疗组MCP-1明显升高，差异有显著统计学意义(P＜0.01)；在化疗的同时，予以果王素干预，其MCP-1降低，且与果王素呈剂量相关性，高剂量果王素有更明显的降低MCP-1作用；与对照组比较，化疗组IL-2明显降低，差异有显著统计学意义(P＜0.01)；在化疗的同时，予以果王素干预，其IL-2升高，且与果王素呈剂量相关性，高剂量果王素有更明显的升高IL-2作用，见表4。

表4 各组小鼠血浆中MCP-1和IL-2比较(±s)

表4 各组小鼠血浆中MCP-1和IL-2比较(±s)

注：与对照组比较，aP＜0.01；与化疗组比较，bP＜0.01。

组别MCP-1(PG/ML)IL-2(PG/ML)对照组(n=8)化疗组(n=8)低剂量果王素联合化疗组(n=8)高剂量果王素联合化疗组(n=8) 52.76±14.93 153.43±25.31a92.26±23.01ab59.75±18.42ab18.29±1.67 10.54±0.79a12.27±1.22ab16.53±1.35ab

3 讨论

肺癌是恶性肿瘤的第一位死因，非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌总数的75%左右。NSCLC被发现时，仅有不到1/3的患者有手术指征，能经手术而根治，而大部分患者是丧失了手术机会的中晚期患者[2-3]。对于中晚期NSCLC患者，化疗是主要的治疗手段，但目前常用抗肿瘤化疗药物多为化学合成的细胞毒类药物，对正常细胞和癌细胞选择性较差，有时化疗过程中会出现严重的毒副作用，其中骨髓抑制是常见的毒副作用，严重的白细胞和血小板的减少会导致患者并发感染和出血，严重影响患者的生命质量和治疗效果，甚至导致死亡，对化疗的实施造成障碍。寻找抑制化疗副作用及保护脏器功能的药物成为一项重要课题。果王素为猕猴桃果仁提取的果仁油脂肪酸，主要成分为α亚麻酸，其药用和保健价值早有报道[4]。早期研究发现果王素对化疗致心肌损害有一定防治作用[5]，但果王素对化疗骨髓抑制的防治作用仍未见报道。

顺铂和吉西他滨皆有一定骨髓抑制作用，顺铂联合吉西他滨为GP方案，是NSCLC常用的一线化疗方案，两药联用，骨髓抑制的风险增加。在我们的研究中，化疗组中红细胞，白细胞，血小板较对照组明显减少，其中白细胞和血小板的减少尤为明显，与对照组比较差异有显著统计学意义(P＜0.01)；骨髓有核细胞计数主要反映骨髓造血功能，化疗后，骨髓有核细胞明显减少，较对照组比较差异有显著统计学意义(P＜0.01)，证实了GP方案的骨髓抑制作用。予以果王素干预后，白细胞和血小板总数明显升高，低剂量果王素组和高剂量果王素组中白细胞和血小板数与化疗组比较差异皆有显著统计学意义(P＜0.01)；同时果王素干预组中骨髓有核细胞的下降明显减轻，且与果王素的剂量有关，果王素干预组与化疗组比较差异有显著统计学意义(P＜0.01)；大剂量果王素组在升高外周血细胞及骨髓有核细胞有更明显的作用，说明果王素对GP方案化疗所致的骨髓抑制有明显的防治作用，且其防治作用与剂量相关，大剂量果王素有更为明显的防治作用。当然，我们也注意到，各组红细胞的比较差异无统计学意义，可能与化疗主要损伤处于增殖周期的细胞[6]，化疗药物对增殖周期短的白细胞和血小板损伤最强，化疗后数量下降明显，而红细胞增殖周期长，在短时期内无法反映出明显变化有关。

化疗药物导致骨髓抑制的机理较为复杂，目前有研究表明免疫损害是导致骨髓抑制的重要机理之一[6-7]，由于化疗药物对肿瘤细胞缺乏特异选择性杀伤作用，其在杀伤癌细胞的同时也损伤了正常细胞，损害机体的免疫功能。在免疫调节系统中，IL-2作为T细胞生长因子参与免疫调节，IL-2生成减少，机体的免疫功能下降[8]，胸腺是主要的免疫器官，胸腺指数能反映机体的免疫水平。本研究中，化疗组中小鼠血清IL-2及胸腺指数明显下降，表明GP方案化疗对小鼠免疫机能产生明显抑制，结果与既往文献一致[6]，在果王素干预下，小鼠血清IL-2及胸腺指数明显回升，与化疗组比较差异有显著统计学意义(P＜0.01)，说明果王素显著减轻了化疗的免疫损害，减轻了骨髓抑制的副反应。亦有研究表明骨髓造血微环境的损伤可造成明显骨髓抑制[9-10]，很多因素可作用造血微环境，其中氧化及抗氧化失衡与骨髓造血功能有密切关系，胞内ROS活性低的造血干细胞具有更高的自我更新潜能，而ROS活性高的造血干细胞自我更新和造血重建能力明显下降[11]。与氧化及抗氧化有关的物质中，SOD能清除氧自由基，有抗氧化作用，其活力反映机体清除氧自由基的能力[12]；MPO是过氧化物酶类，由中性粒细胞释放，其活性可评价中性粒细胞在组织中浸润的程度[13]。T-AOC可评价体内酶性和非酶性抗氧化物的总体水平，可综合反映组织抗氧化能力[14-15]。本实验结果表明，化疗组小鼠SOD和T-AOC的活性均明显减低，表明机体总抗氧化能力下降，清除氧自由基减少；化疗组MPO活性较对照组明显增高，反映了PMN在骨髓内大量浸润。应用果王素干预可使SOD及T-AOC有所恢复，表明其可增强机体的抗氧化能力，同时，MPO活性下降，表明中性粒细胞在组织中浸润减少，因中性粒细胞呼吸爆发产生的氧自由基减少，对机体起到保护作用，由于氧化应激的减轻，对造血微环境的损害减轻，从而减轻化疗对小鼠骨髓抑制的作用。近年来，趋化因子在一些疾病中的作用引起人们的重视，MCP-1是一种多种细胞均能产生的趋化性细胞因子，它能趋化单核细胞、T淋巴细胞和肥大细胞等向炎症部位聚集，使炎症反应加重，引起免疫病理损伤，损害脏器结构和功能[16-17]，笔者研究发现，化疗组中血清MCP-1表达明显升高，予以果王素干预后，其表达下降，提示化疗导致炎症反应增加，果王素能抑制其炎症反应，可能与减轻骨髓抑制有一定关系。

综上所述，GP方案对小鼠肺癌化疗可出现明显的骨髓抑制作用，而果王素有一定的防治作用，其机理可能与增强免疫、减轻氧化应激、抑制炎症反应相关，果王素有望在临床用于防治化疗骨髓抑制作用，但其具体机理如增强免疫、减轻氧化应激、抑制炎症反应的相互关系有待进一步研究。

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Effect of Kiwi essence in the prevention and treatment of bone marrow inhibition in mouse models of lung cancerundergoing GP chemotherapy regimen.

HE Jian-bin1,YI Gao-zhong1,XIANG Zhi1,TANG Jian-xin1,DENG Xiang2, ZHANG Ping1.1.Department of Respiration,First People's Hospital of Huaihua,the Afiliated Hospital of Hunan University of Medicine,Huaihua 418000,Hunan CHINA;2.Department of Respiration,the First Affiliated Hospital of Nanhua University,Hengyang 421001,Hunan,CHINA

ObjectiveTo investigate the protective effect of Kiwi essence for bone marrow inhibition in mouse models of lung cancer undergoing GP chemotherapy regimen,and to explore the related mechanisms.MethodsThirty-two C57BL/6J mice bearing Lewis cells were randomized into control group,chemotherapy group,low-dose Kiwi essence combined chemotherapy group and high-dose Kiwi essence combined chemotherapy group,with 8 mice in every group.The mice were given corresponding drug intervention on the 4thday after establishment of models,and then sacrificed on the 24thday.Blood samples(2 ml)were collected from eye venous plexus in each group for routine blood test and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),with the serum levels of monocyte chemotactic protein-1(MCP-1) and interleukin-2(IL-2)determined.Femur samples were collected for bone marrow nucleated cell counts and determi-nation of the levels of myeloperoxidase(MPO),superoxide dismutase(SOD),and total antioxidant capacity(T-AOC). Thymus gland was taken to determine the weight of thymus and thymus index.ResultsThere was no statistically significant difference between the four groups in WBC(P＞0.05).Compared with control group and chemotherapy group, WBC,blood mononuclear cell(BMNC),thymus index,SOD and T-AOC in low-dose Kiwi essence combined chemotherapy group and high-dose Kiwi essence combined chemotherapy group showed statistically significant difference(P＜0.05).Compared with chemotherapy group,WBC,blood platelet(PLT),BMNC,thymus index,SOD,T-AOC and IL-2 in low-dose Kiwi essence combined chemotherapy group and high-dose Kiwi essence combined chemotherapy group were significantly increased(P＜0.05),while MPO and MCP-1 were significantly decreased(P＜0.05).ConclusionKiwi essence can significantly reduce the degree of bone marrow inhibition in chemotherapy.The possible mechanism may be associated to its effect of enhancing immune function,removing oxygen free radicals,inhibiting oxidative stress and inhibiting inflammatory reaction.

Kiwi essence;α-linolenic acids;Chemotherapy;Bone marrow inhibition;Oxidative stress;Inflammation reaction

R-332

A

1003—6350（2016）02—0176—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.02.002

2015-09-01)

湖南省教育厅科研基金（编号：2013C735）；湖南省中医药管理局科研基金（编号：201281）

贺兼斌。E-mail：hjb0919@aliyun.com