放射性125I粒子对肺癌A549细胞裸鼠移植瘤VEGF表达的影响

吴立兵，刘刚，王卫民

(十堰市太和医院湖北医药学院附属医院核医学科，湖北十堰442000)

放射性125I粒子对肺癌A549细胞裸鼠移植瘤VEGF表达的影响

吴立兵，刘刚，王卫民

(十堰市太和医院湖北医药学院附属医院核医学科，湖北十堰442000)

目的探讨放射性125I粒子对肺癌A549细胞裸鼠移植瘤血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响。方法建立肺癌A549细胞裸鼠移植瘤模型，将24只小鼠随机分为对照组和观察组，每组12只。观察组小鼠植入125I粒子，对照组小鼠植入空白粒子。检测裸鼠移植瘤体积、瘤重，计算抑瘤率。采用免疫组织化学法检测移植瘤组织内VEGF蛋白表达。采用PCR法检测移植瘤组织内VEGF mRNA表达。结果观察组小鼠移植瘤体积及瘤重[(0.658±0.213)g]均明显小于对照组[(1.807±0.625)g]，组间比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)；观察组小鼠平均抑瘤率为(68.2±5.3)%；观察组移植瘤中VEGF蛋白表达及VEGF mRNA表达分别为(22.6±5.9)、(98.7±8.2)，均明显低于对照组的(58.5±6.4)、(138.7±5.2)，组间比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)。结论放射性125I粒子植入可显著抑制肺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长，抑制VEGF表达可能是其主要作用机制。

肺癌；放射性125I粒子；血管内皮细胞生长因子；表达

肺癌是临床常见的恶性肿瘤之一。近几十年来，随着汽车尾气、工业污染等问题所导致的大气污染日趋严重，肺癌的发病率及病死率居高不下，已成为严重威胁世界人民健康的公共卫生问题[1]。由于起病隐匿，约85%的肺癌患者确诊时已为晚期，失去了最佳的手术机会[2]。放射性125I粒子是一类人工同位素，将其直接植入肿瘤内可持续释放射线，起到杀伤肿瘤细胞的作用，是晚期肺癌治疗的重要手段之一[3-4]。由于125I粒子治疗肺癌的作用机制尚未明确，本研究拟通过观察125I粒子对肺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长及其对移植瘤组织血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)表达的影响，探讨125I粒子治疗肺癌的作用机制，旨在为临床治疗提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 材料肺癌细胞株A549(ATCC细胞库，美国)；RNA提取试剂盒、PCR试剂盒、质粒提取试剂盒(Invitrogen，美国)；DMEM培养基、磷酸盐缓冲液(PBS)、胰蛋白酶(Gibco公司，美国)；MTT(Sigma，美国)；VEGF兔源单克隆抗体(Santa Cruz公司，美国)；免疫组化试剂盒(南京建成生物有限公司，中国)。试验动物：24只BALB/c小鼠，雌性，8周龄，体重18～22 g，SPF级，购于上海斯莱克试验动物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养复苏A549，PBS洗涤3次，DMEM培养基洗涤3次，用含有10%胎牛血清和双抗的DMEM培养液将细胞混匀，37℃、5%CO2培养箱中培养，每天换液1次。

1.2.2 裸鼠模型制备收集对数生长期的A549并配成浓度为3×107个/ml单细胞悬液。每只裸鼠背部皮下注射0.2 ml上述细胞悬液后常规饲养。待移植瘤直径达5 mm时可视为接种成功。

1.2.3 动物分组及给药按随机数字表法将模型小鼠分为对照组和观察组，每组12只。待肿瘤体积达到120 mm3时观察组小鼠植入125I粒子，对照组小鼠植入空白粒子。粒子植入前应做好防护工作，125I粒子浸泡于戊二醛中消毒30 min，植入部位常规消毒，采用18号植入针在距肿瘤边缘5 mm处刺破皮肤，并于皮下潜行至肿瘤中心部位，植入粒子。常规饲养，连续观察28 d后断颈处死。

1.3 肿瘤生长情况分别于植入粒子前、植入粒子后7 d、14 d、21 d、28 d，测量肿瘤体积，肿瘤体积= (长径×短径2)/2。植入粒子后28 d取出瘤体，称重，计算肿瘤抑制率，肿瘤抑制率=(对照组平均瘤重-观察组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。

1.4 VEGF蛋白表达采用免疫组织化学法检测移植瘤组织VEGF蛋白表达。常规制备移植瘤组织切片，3%H2O2阻断内源性过氧化酶活性，组织抗原修复，封片，滴加VEGF一抗(1:1 000)，4℃孵育过夜，洗片，二抗室温孵育1 h，链霉素抗生素蛋白工作液孵育，DAB显色，复染、脱水、透明、固定。PBS代替一抗作为对照组。在细胞质、细胞核、细胞膜中呈现棕黄色为阳性。图像分析：在20倍物镜下，随机选取100个阳性细胞检测平均灰度值，平均灰度值=(背景灰度值-实测灰度值)，平均灰度值越小，则代表VEGF蛋白表达越高。

1.5 VEGF mRNA表达采用PCT法检测移植瘤组织VEGF mRNA表达。常规提取总RNA，按照反转录试剂盒说明书进行反转录，所得反应产物进行PCR扩增(SYBR Green法)。以GAPDH为内参，引物序列，见下表1。

表1 引物序列

1.6 统计学方法采用SPSS18.0统计软件进行数据处理，计量资料以均值±标准差(±s)表示，组间差异比较采用两独立样本t检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤生长情况治疗后观察组移植瘤体积均显著小于对照组，组间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图1；治疗后28 d，对照组和观察组瘤重分别为(1.807±0.625)g、(0.658±0.213)g；观察组平均抑瘤率为(68.2±5.3)%。

图1 两组各时点移植瘤体积比较

2.2 VEGF蛋白表达免疫组化检测结果显示，治疗后28 d观察组和对照组VEGF灰度值分别为(98.7±8.2)、(138.7±5.2)；观察组移植瘤的VEGF灰度值明显低于对照组，组间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图2。

2.3 VEGF mRNA表达PCR结果显示，治疗后28 d对照组和观察组VEGF mRNA表达分别为(58.5±6.4)、(22.6±5.9)，观察组移植瘤中VEGF mRNA表达明著低于对照组，组间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。

图2 治疗后28 d各组小鼠移植瘤VEGF阳性表达情况

3 讨论

放射性125I粒子植入是一种治疗恶性肿瘤的新方法[5]。与外放射治疗相比较，采用放射性125I粒子体内近距离植入放疗可对靶肿瘤产生持续、低剂量的照射作用，从而大大提高放疗的持久性和准确性[6-7]。大量研究证实，采用放射性125I粒子植入治疗中晚期肺癌具有较高的安全性，且近期疗效肯定[8]。但放射性125I粒子植入治疗的作用机制尚未完全明确。

血管新生是恶性肿瘤的生长特性，也是恶性肿瘤生长、转移的先决条件。VEGF作为已知活性最强的促血管生成素，可通过与血管内皮细胞膜表面的VEGF受体(Vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)相结合，激活多条信号转导通路，介导级联反应，诱发血管内皮细胞有丝分裂，促进内皮细胞增殖和血管生成，从而参与血管新生过程，其表达水平与恶性肿瘤的发生发展密切相关[9]。姚传山等[10]研究证实，肺癌组织中VEGF呈现高表达，与癌旁组织比较差异有统计学意义(P＜0.05)，且VEGF表达阳性率与肿瘤TNM分期及有无淋巴转移有关。张泳等[11]采用RNAi干涉法沉默A549中VEGF表达，并将其接种于裸鼠，结果显示沉默VEGF表达可明显抑制裸鼠内皮细胞小管形成，抑制移植瘤生长，延长裸鼠生存期，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。因此认为，调控VEGF表达对于控制肺癌进展、远处转移及复发等均具有重要意义[12]。本研究结果显示，放射性125I粒子植入后，肺癌A549细胞裸鼠移植瘤组织中VEGF蛋白表达及mRNA表达均显著减少，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，提示放射性125I粒子植入可抑制肺癌移植瘤组织中VEGF高表达，从而对肿瘤血管新生发挥着一定的调控作用[13]。此外，本研究还观察到放射性125I粒子植入后肺癌A549细胞裸鼠移植瘤体积和重量明显减少，抑瘤率高达(68.2±5.3)%，与徐燕等[14]研究报道一致，因此抑制VEGF表达可能是放射性125I粒子发挥抑瘤作用的主要机制。

综上所述，放射性125I粒子植入可显著抑制肺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长，抑制VEGF表达可能是其主要作用机制。关于放射性125I粒子植入是否还通过调节其他活性因子及信号通路发挥杀伤恶性肿瘤细胞的作用仍未知，有待进一步深入研究。

[1]Couraud S,Zalcman G,Milleron B,et al.Lung cancer in never smokers-a review[J].European Journal of Cancer,2012,48(9):1299-1311.

[2]程星,李青,谢启超.放射性碘125粒子植入联合高频热疗治疗晚期肺癌的近期疗效观察[J].重庆医学,2014,43(24):3199-3200.

[3]田冲.放射性碘-125粒子植入治疗肺癌的临床疗效观察[J].中国医药指南,2013,11(4):381-382.

[4]迟福生,姜红千,王振元,等.125I放射性粒子治疗高龄晚期肺癌46例临床分析[J].中国基层医药,2015,22(5):752-753.

[5]徐仁良,华双一,查清,等.BACE联合125I粒子植入治疗晚期肺癌的临床疗效[J].临床肺科杂志,2015,20(2):242-244.

[6]杨文魁,陈勇,王磊,等.CT引导下125I粒子植入联合GP方案治疗局部进展期胰腺癌[J].世界华人消化杂志,2014,22(10): 1455-1459.

[7]郑桂丽,王俊.碘125粒子组织间植入治疗癌性疼痛的疗效与安全性[J].海南医学院学报,2015,21(4):36-37.

[8]时代,张雪宁,牛冬梅,等.CT引导下单纯125I粒子植入治疗中晚期非小细胞肺癌的近期疗效观察[J].中国临床医学影像杂志, 2013,24(4):283-285.

[9]王可毅,解基严,闫天生,等.VEGF-C在非小细胞肺癌中的表达及与恶性程度关系的研究[J].中国微创外科杂志,2013,13(4): 352-356.

[10]姚传山,马磊,赵旭林,等.CD34,VEGF在非小细胞肺癌中的表达及意义[J].中国实用医药,2014,2(35):28-29.

[11]张泳,谷仲平,周勇安,等.RNAi沉默VEGF的表达及其治疗肺癌的初步研究[J].细胞与分子免疫学杂志,2009,25(4):341-343.

[12]吕进,曹秀峰,朱斌,等.放射性125I粒子植入联合经肝动脉化疗栓塞治疗肝细胞癌的临床研究[J/CD].中华临床医师杂志(电子版), 2012,4(3):34-35.

[13]陈亿,罗开元,李晓刚,等.组织间植入125I粒子对大肠腺癌细胞HCT-116诱导凋亡及增殖抑制的影响[J].世界华人消化杂志, 2010,18(27):2858-2859.

[14]徐燕,刘希光,李明军.125I粒子组织间植入对小鼠Lewis肺癌细胞VEGF-C和COX-2表达影响[J].齐鲁医学杂志,2009,24(4): 295-297.

Effect of radioactive125I seed on expression of VEGF in lung cancer A549 cell of nude mice.

WU Li-bing,LIU Gang, WANG Wei-min.Department of Nuclear Medicine,Shiyan Taihe Hospital(Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine),Shiyan 442000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo evaluate the effect of radioactive125I seed implantation on expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)in lung cancer A549 cell of nude mice.MethodsLung cancer xenograft models on nude mice were established,which were divided into control group and observation group randomly,with 12 mice in each group.The observation group was implanted with125I seed,and the control group was given blank seed.The size and weight of xenograft tumor were detected,and the tumor inhibition rate was calculated.The expression of VEGF protein in xenograft tumor was detected by immunohistochemical method.The expression of VEGF mRNA in xenograft tumor was detected by PCR method.ResultsThe size and weight of xenograft tumor in the observation group were significantly less than those in the control group[(0.658±0.213)g vs(1.807±0.625)g],with statistically significant difference(P＜0.05).The tumor inhibition rate of the observation group was(68.2±5.3)%.The expression of VEGF protein and VEGF mRNA of xenograft tumor in the observation group[(22.6±5.9),(98.7±8.2)]were significantly lower than those in the control group[(58.5±6.4),(138.7±5.2)],with statistically significant difference(P＜0.05).ConclusionRadioactive125I seed can significantly inhibit the growth of xenograft tumor of lung cancerA549 cell in nude mice,and inhibition of VEGF expression may be the main mechanism.

Lung cancer;Radioactive125I seed;Vascular endothelial growth factor(VEGF);Expression

R-332

A

1003—6350（2016）02—0183—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.02.004

2015-07-07)

吴立兵。E-mail：wuerfan@sina.com