胃肠道间质瘤临床病理及c-KIT基因检测

司海鹏，许红英，李惠，陈劼，王剑蓉

(南京中医药大学附属医院病理科，江苏 南京 210029)

胃肠道间质瘤临床病理及c-KIT基因检测

司海鹏，许红英，李惠，陈劼，王剑蓉

(南京中医药大学附属医院病理科，江苏 南京 210029)

目的 探讨胃肠道间质瘤(Gastrointestinal stromal tumors，GIST)的临床病理、免疫组织化学和c-KIT基因突变情况。方法收集我院2010年4月至2012年12月收治的26例经手术切除病理确诊的GIST患者，对26例病例采用免疫组织化学行c-KIT蛋白(CD117)、CD34、平滑肌肌动蛋白（SMA)、人S100蛋白(S-100)检测，以确诊为GIST。采用直接测序方法对c-KIT基因11、9、13、17号的外显子突变进行序列分析。结果26例病例中CD117阳性为22例，共14例(53.8%)检测到c-KIT突变，第11外显子是KIT基因最常见的突变位点，检测到的突变形式主要有缺失突变，点突变和插人突变，均为杂合性突变。结论CD117阳性及c-KIT突变是GIST的普遍现象，突变位点有集中趋势，以梭形细胞型突变最常见。

胃肠道间质瘤；病理；c-KIT基因；检测

胃肠道间质瘤(Gastrointestinal stromal tumors，GIST)是梭形和或上皮样细胞组成的的间叶性肿瘤，起源于肠道的起搏细胞、消化道Cajal细胞[1](Intestinal cell of Cajal，ICC)。近年来，随着对肿瘤疾病机制的分子研究发现[2]，92%～95%的GIST患者CD117 (KIT蛋白)染色阳性，而KIT基因突变会导致酪氨酸激酶持续激活，被认为与超过90%的恶性GIST发生发展相关。而作为一种KIT酪氨酸激酶抑制剂的伊马替尼(Imatinib mesylate STI-571)，又名格列卫(Gleevec)，已越来越多的应用于转移性和难于手术切除的病例。在我国，GIST的病例已积累很多，但相关的基因检测研究还较少，此次我们检测了我科26例GIST的免疫组化和基因突变情况，并进行总结，以加深GIST分子病理学特点并为患者生物靶向治疗提供一定依据。

1 资料与方法

1.1 标本及分级 收集我院2010年4月至2012年12月收治的26例GIST患者，经手术切除病理确诊。根据Fletcher等[3]推荐标准(依肿瘤直径、核分裂像将GIST生物学行为)分为4级：肿瘤直径＜2 cm且核分裂像＜5/50 HPF为极低度侵袭危险性；直径2～5 cm且核分裂像＜5/50 HPF为低度侵袭危险性；直径5～10 cm且核分裂像＜5/50 HPF或者肿瘤直径＜5 cm但核分裂像6～10/50 HPF为中度侵袭危险性；直径＞5 cm且核分裂像＞5/50 HPF或者肿瘤直径＞10 cm或当核分裂像＞10/ 50 HPF均为高度侵袭危险性。

1.2 免疫组化 按常规组织脱水、包埋方法，将石蜡组织制成4 μm连续切片，采用Envision两步法行免疫组化标记，一抗为CD117、CD34、SMA、S-100(均购自Dako公司)。染为棕黄色为阳性，CD117阳性细胞为胞膜着色；S-100阳性细胞定位于胞核和胞质；CD34、SMA为胞质染色，所有病例均经2位病理医生一起复查。

1.3 基因序列和引物 跟据美国国立医学图书馆提供的序列，并用Oligo软件设计PCR引物。c-KIT基因9号外显子上游：5′-AGTATGCCACATCCCAAGT GT-3′；下游:5′-TGGTAGACAGAGCCTAAACAT-3′。11号外显子上游：5′-TGATTGGTTTCGTAATCGTAG-3′；下游：5′-AACAAAACAAAGGAAGCCACT-3′。17号外显子上游：5′-AACATCATT CAAGGCGTACTT-3′；下游：5′-AAATCCTTTGCAGGACTGTCA-3′。

1.4 基因测序方法 按照Omega公司试剂盒说明书步骤,先提取出肿瘤组织DNA，凝胶电泳系统检测DNA含量，大于20 ng/μl纳入检测；PCR扩增，体系内包括2 μl的10×PCR Buffer，0.2 μl的HotStar Taq DNA Polymerase(QIAGEN公司)，4 μl的5×Q-Solution，2 μl的dNTP，上下游引物各1μl，1 μl模板DNA，8.8 μl的去离子水；PCR产物纯化；测序反应和纯化，包含1 μl BigDye，1.5 μl BigDye Seq Buffer，3 μl引物，1 μl PCR纯化产物，3.5 μl ddH2O经过25个热循环后测序反应后纯化；先选择正确的分析模块，采用3100-Avant分析仪进行基因测序，并进行数据处理和分析。若发现病例出现缺失或突变的病例，都要进行反向测序进行验证。用DNA5.1测序分析软件获取电泳图和序列，并与基因库里的标准序列比对，观察样本序列。

1.5 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件完成数据分析，率的比较采用χ2检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 肿瘤细胞CD117阳性(×400)

2 结 果

2.1 患者临床资料 26例GIST患者中男性10例，女性16例，年龄31～78岁，平均56.54岁。主要症状为腹胀、腹痛、腹部包块、便血。肿瘤原发部位：食道2例，胃15例，肠8例，盆腔1例，其中1例十二指肠GIST肝转移。

2.2 肿瘤特点 依据镜下组织学形态，将26例GIST分为梭形细胞型20例，上皮样细胞型2例，两者混合型4例。肿瘤直径＜2 cm者8例，直径2～5 cm者7例，直径5～10 cm者4例，直径＞10 cm者7例。26例GIST的侵袭危险性属于极低度的有7例、低度的有6例、中度的有4例、高度的有9例。

2.3 免疫组化结果 26例病例中CD117阳性为22例，CD34阳性为20例，证实为胃肠道间质瘤，SMA及S-100均为阴性或者局灶阳性，排除平滑肌瘤和神经鞘瘤，见图1。

2.4 c-KIT基因突变分析 26例GIST中共14例(53.8%)检测到c-KIT突变，发现外显子11突变的有13例，占全部病例的50%以及KIT突变病例的92.9%；外显子9发生突变的有1例，占全部病例的3.8%以及KIT突变病例的7.1%；此次未检出外显子17的突变。免疫组化CDI17阳性的病例中有14例检测到KIT突变，有8例未发生突变；而4例CD117阴性GIST中未能检测到c-KIT外显子突变。第11外显子是KIT基因最常见的突变位点(图2)，检测到的突变形式主要有缺失突变，点突变和插人突变，均为杂合性突变。缺失突变是外显子11最常见的突变类型，共检测出7例(占53.8%)，为几个至几十个碱基的缺失；其次为点突变4例(占30.8%，其中3例T/A杂合，1例T/C杂合突变)和插人突变1例(7.7%)，为第11外显子583位密码子第二碱基后插入30个碱基(-AACACAACTTCCTTATGATCACAAATGGGA-)；还有1例第11外显子呈错义杂合突变，为V569R，并自570密码子开始缺失24个碱基序列(-TACATAGACCAACACAACTTCCT-)，产生截短蛋白。共有8例(61.5%)突变发生在5端的“热点”区域，即第550～560密码子附近，共检测出2例发现第557和558密码子的缺失，占KIT外显子突变的14.3%。第9外显子突变仅见于1例样本，为第9外显子GCCTAT6个碱基插入突变。

图2 c-KIT第11外显子突变

2.5 基因突变与临床病理联系 本研究中肿瘤原发于食道2例，胃15例，肠8例，盆腔1例，其c-KIT突变例数分别为0、9、5、0例。在梭形细胞型，上皮样细胞型和两者混合型GIST中的突变率分别为85.7%(12/20)、50%(1/2)、25%(1/4)，组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)；而在极低、低、中至高度侵袭危险性肿瘤组织的突变率分别为28.6%(2/7)、50% (3/6)、75%(3/4)及66.7%(6/9)，不同侵袭危险性之间比较差异无统计学意义(χ2=2.06，P＞0.05)。第9外显子突变的患者为男性，发生于小肠肠壁内及浆膜外生物学行为属高危险度。

3 讨 论

胃肠道间质瘤(GIST)是最常见的胃肠道间叶组织来源肿瘤，由梭形和或上皮样细胞组成，现认为起源于肠道的起搏细胞、消化道Cajal细胞(ICC)。据文献报道，GIST发生部位：60%～70%在胃，25%在小肠，10%在结直肠，其他胆囊、阑尾、网膜等处偶可发生[4-5]。本组资料中以胃最多见，其次是肠道，与文献报道基本一致。肿瘤小者可只位于胃壁内，表面光滑，大者可从胃壁向浆膜外生长。切面灰白、灰红色，质地中等，可伴有出血、坏死、囊性变。在我们观察的26例GIST中，发现梭形细胞型20例：瘤细胞呈长梭形，核呈梭形或杆状，可见核端空泡，胞浆嗜碱或嗜酸，瘤细胞呈编织状排列，部分呈栅栏状。上皮样细胞型2例：瘤细胞呈圆型或卵圆型，胞浆较丰富，部分呈印戒细胞样，可见瘤巨细胞，呈巢团或菊形团状排列。两者混合型有4例：兼有上述两种细胞特征。观察中发现GIST病例中，部分细胞排列呈器官，间质有粘液样基质，有的瘤细胞核大、深染、异型明显，易见核分裂，伴有明显的出血、坏死，符合肉瘤样细胞特征[6]。

1998年Hirota等[7]首次发现GIST中存在KIT基因功能突变及蛋白产物的表达，定位于人染色体4q12，是一种原癌基因，其蛋白产物CD117为酪氨酸激酶受体，为编码相对分子质量145 000的跨膜糖蛋白，由4部分结构域组成(膜外区、跨膜区、近膜区和酪氨酸激酶)，表达于人体的肥大细胞、造血干细胞、生殖细胞等。在正常情况下，KIT受体在配体SCF的激活下使底物蛋白磷酸化[8]，触发下游蛋白分子级联反应，从而参与细胞重要生理活动的调控如增殖、凋亡等。而KIT基因突变使KIT受体在无配体结合的情况下仍能持续激活，从而导致肿瘤的发生。

根据Fletcher推荐侵袭危险性分级标准，我们此次研究的26例GIST中属于极低度危险的有7例、低度的有6例、中度的有4例、高度的有9例。根据免疫组化结果分析，26例病例中CD117阳性为22例，CD34阳性为20例。在CD117阳性的病例中有14例检测到KIT突变，有8例未发生突变；4例CD117阴性GIST中也未能检测到c-KIT外显子突变。可能由于样本量较少，未检测到基因突变，今后研究中还需要增加样本量来验证。在梭形细胞型，上皮样细胞型和两者混合型GIST中的突变率分别为85.7%(12/20)、50%(1/2)、25% (1/4)，组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)；而在极低、低、中至高度侵袭危险性肿瘤组织的突变率分别为28.6%(2/7)、50%(3/6)、75%(3/4)及66.7%(6/9)，不同侵袭危险性之间比较差异无统计学意义(χ2=2.06，P＞0.05)，与研究结果相同[9]。提示c-KIT突变可能是GIST的普遍现象，其有无与肿瘤侵袭危险性无明显相关。

文献报道GIST患者KIT基因突变较高，突变率为40%～90%[10]，最易于发生突变的四个区域，即外显子9、11、13和17。而大多数(约65%)KIT基因突变在近膜域(外显子11)，其次(约9%)在膜外域(外显子9)，最常发生于外显子11第550～560密码子和第570～580密码子的“热点区域”[11]。而外显子13和外显子17突变较罕见(1%～2%)。本研究在26例GIST中共检测到14例(53.8%)c-KIT突变，发现外显子11突变的有13例，占全部病例的50%以及KIT突变病例的92.9%;外显子9发生突变的有1例，占全部病例的3.8%以及KIT突变病例的7.1%；此次未检出外显子17的突变。我们检测的第11外显子的突变形式主要有缺失突变，点突变和插人突变，均为杂合性突变。缺失突变是外显子11最常见的突变类型，共检测出7例(占53.8%)，为几个至几十个碱基的缺失；其次为点突变4例(占30.8%，其中3例T/A杂合，1例T/C杂合突变)和插人突变1例(7.7%)，为第11外显子583位密码子第二碱基后插入30个碱基(-AACACAACTTCCTTATGATCACAAATGGGA-)；还有1例第11外显子呈错义杂合突变，为V569R，并自570密码子开始缺失24个碱基序列(-TACATAGACCAACACAACTTCCT-)，产生截短蛋白，提示用基因靶向药物格列卫治疗可有较好疗效。外显子11突变最常见的是删除一个或多个密码子，其中有些(密码子557-558)会引起不良临床后果，而错义点的突变预后较好[12]。Vadakara等[13]研究100多例GIST患者，发现86%的患者有c-KIT基因第11号外显子突变，缺失突变会有更差的预后，而点突变比缺失突变更能提示良好的预后，所以可作为独立的预后因素。类似的近期研究[14]得出与其一致的结果。外显子9的突变比较少见[4]，常见的形式是第502和503密码子的GCCTAT6个核昔酸串联重复插人，研究显示多发生在小肠GIST，侵袭性通常较高。本实验仅发现1例9号外显子突变为这种形式，患者男性，发生于小肠肠壁内及浆膜外生物学行为属高危险度。

这些研究结果对提高GIST诊断的准确性以及靶向治疗有一定的启示。随着靶向药物越来越多的应用，可提高晚期GIST患者的中位生存时间，也可作为GIST患者预后判断的有效指标之一，所以从基因水平上研究疾病诊断、预后、治疗将有待更多研究证实。

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Clinicpathological features and c-KIT gene detection of gastrointestinal stromal tumor.

SI Hai-peng,XU Hong-ying,LI Hui,CHEN Jie,WANG Jian-rong.Department of Pathology,the Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210029,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo explore the clinicopathological,immunohistochemical features and c-KIT gene mutations of gastrointestinal stromal tumors(GIST).MethodsTwenty-six patients of GIST confirmed pathologically in our hospital from Apr.2010 to Dec.2012 were detected for CD117,CD34,smooth muscle actin(SMA)and S-100 with immunohistochemistry to confirm the diagnosis.Direct sequencing technique was used to identify the mutation of c-KIT (exon 9,11,13,17).ResultsAmong the 26 patients,there were 22 patients with CD117 positive and 14 patients(53.8%) with mutations of c-KIT.Mutations of c-KIT exon 11 were mostly detected,mainly deletion,point mutation and insertion.ConclusionCD117 positivity and c-KIT mutation are common in GIST,and they are mostly detected in spindle-cell GISTs.

Gastrointestinal stromal tumor;Pathology;c-KIT gene;Detection

R735

A

1003—6350（2016）05—0706—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.05.006

2015-07-31)

司海鹏。E-mail：mtshp@sina.com