Noxa蛋白在肝外胆管癌组织中的表达及其与临床病理的关系

胡海霞，李伟，熊正文，李宏伟，黄勇，牛晓东

(中国人民解放军第251医院病理科，河北 张家口 075000)

Noxa蛋白在肝外胆管癌组织中的表达及其与临床病理的关系

胡海霞，李伟，熊正文，李宏伟，黄勇，牛晓东

(中国人民解放军第251医院病理科，河北 张家口 075000)

目的 研究Noxa蛋白在肝外胆管癌及正常组织中的表达，同时探讨其与患者临床病理因素的关系。方法收集2006年3月至2009年6月我院肝外胆管癌和正常组织各70例，并采取免疫组织化学(EnVisionTM)法分别检测Noxa蛋白在肝外胆管癌组织及正常组织中的表达情况。结果Noxa在肝外胆管癌组织、正常组织阳性表达率分别为32.86%(23/70)、68.57%(48/70)，两者比较差异有统计学意义(χ2=17.86，P＜0.01)；肝外胆管癌组织Noxa的表达与TNM分期、淋巴结转移有关(P＜0.05)，但与性别、年龄、肿瘤直径、组织学分化、浸润深度及神经受累无关(P＞0.05)；Noxa阳性表达的患者5年生存率低于Noxa阴性表达者[26.09%(6/23)vs 53.19%(25/47)]，差异有统计学意义(χ2=4.59，P＜0.05)。结论肝外胆管癌组织中Noxa蛋白的低表达不仅表明了癌细胞促凋亡能力的异常，而且也有利于预测淋巴结转移及临床分期的状态，同时也可作为判断患者预后的参考指标。

肝外胆管癌；Noxa蛋白；临床病理；表达

胆管癌是胆管上皮细胞受到各种因素刺激而发生的恶性改变，依据解剖部位分为肝内胆管癌和肝外胆管癌，前者以肝内肿物为主要临床表现，后者以皮肤黄染为主。肝外胆管癌占胆管癌的90%，且常发生于胆总管分叉处[1]。目前，肝外胆管癌的治疗以手术切除为主，以化疗、放疗和生物治疗等为辅，但患者的死亡率改善不明显。为了探讨影响患者死亡率的相关因素，本文研究Noxa蛋白在肝外胆管癌组织中的表达及其与临床病理参数之间的关系，并进一步分析其对患者5年生存预后的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2006年3月至2009年6月期间我院患者资料70例，并经病理活检明确诊断为肝外胆管癌。70例患者中，女性39例，男性31例；年龄38～81岁，中位数年龄56岁；≥56岁46例、＜56岁24例；肿瘤直径≥1.9 cm 37例、＜1.9 cm 33例；高分化腺癌17例，中分化腺癌31例，低分化腺癌22例。浸润深度为肌层13例，浆膜层41例，周围组织16例；神经受累38例，无神经受累32例；淋巴结转移者38例，无转移者32例；临床分期中，Ⅰ期7例，Ⅱ期20例，Ⅲ期35例，Ⅳ期8例。所有患者均为首次接受住院治疗，并电话随访5年。同时选取因胆道梗阻切除的胆管组织70例作为对照组。

1.2 试剂和方法 浓缩型鼠抗人单克隆抗体Noxa及其配套试剂盒、DAB显色剂由武汉博士德生物技术有限公司提供，抗体工作浓度按1:200稀释。方法采取免疫组化染色EnVision两步法，详细步骤参照说明书。阴性对照用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗制成。

1.3 结果判断 Noxa蛋白阳性着色于细胞质，可表现为浅黄色、黄色、棕黄色。判断标准[2]：计数10个高倍视野下阳性着色细胞所占百分比：阳性细胞≤5%为阴性，5%～25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，＞75%为4分；染色强度：0分为无色，1分为浅黄色，2分为黄色，3分为棕黄色。上述两项相乘1～4分(+)，5～8分(++)，9～12分(+++)。染色结果由本科室两名以上病理专家进行双盲评估，并规定总分≤4分均记为阴性，＞4分均记为阳性。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计数资料采用四格表χ2检验，多个率之间的比较采用RxC χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Noxa蛋白在肝外胆管癌组织和正常组织中的表达 Noxa蛋白在70例肝外胆管癌组织中阳性表达23例，阴性表达47例，阳性率为32.86%；而在70例正常组织中阳性表达48例，阴性表达22例，阳性率为68.57%，数据经χ2统计分析，两组之间表达差异有显著统计学意义(χ2=17.86，P＜0.01)，见图1、图2。

2.2 Noxa蛋白的表达与肝外胆管癌临床病理因素的关系 Noxa蛋白男性和女性比较，≥56岁与＜56岁比较，肿瘤直径≥1.9 cm与＜1.9 cm比较，高分化组织、中分化组织及低分化组织比较，肌层癌组织、浆膜层癌组织及周围癌组织中比较，癌组织累及神经组与未受累及比较，差异均无统计学意义(P＞ 0.05)。Noxa蛋白在淋巴结转移与无转移组比较、Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

图1 Noxa蛋白在正常组织阳性表达(EnVisionx100)

图2 Noxa蛋白在肝外胆管癌组织弱阳性表达(EnVisionx100)

表1 Noxa蛋白的表达与肝外胆管癌临床病理因素的关系

2.3 肝外胆管癌组织中Noxa的表达对生存预后的影响 70例肝外胆管癌患者在5年随访期间内，无一例失访。Noxa阳性表达的23例患者中有6例患者存活，5年存活率为26.09%；Noxa阴性表达的47例患者中有25例患者存活，5年存活率为53.19%，数据经统计分析，两组比较差异有统计学意义(χ2=4.59，P= 0.03)，见图3。

图3 Noxa表达对肝外胆管癌患者5年生存预后的影响

3 讨 论

Noxa是Bcl-2家族成员之一，其含有1个BH3结构域，通过此结构域活化线粒体途径进而促进细胞的凋亡。人类Noxa基因定位于第18号染色体长臂21区，长4.301 kb，编码含有54个氨基酸的蛋白质，该蛋白质包含1个BH3结构域和1个线粒体定位域。资料显示，恶性肿瘤组织中Noxa蛋白的异常表达影响细胞的凋亡。董伟等[2]研究发现，Noxa蛋白在胃癌组织中的表达明显低于癌旁组织，其表达与胃癌组织分化程度、临床分期、淋巴结转移和远处转移有关，且Noxa蛋白表达阴性的胃癌细胞凋亡指数明显低于表达阳性者。可见，Noxa蛋白在胃癌组织存在异常表达，其表达水平不利于胃癌的发生、发展。谢奇朋等[3]通过依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡的实验发现，胃腺癌细胞中Noxa表达明显上调，其表达在4 h即开始明显增加，8 h达到高峰，48 h胃腺癌细胞凋亡达50%，这提示依托泊苷诱导胃腺癌细胞发生的凋亡与Noxa表达上调有关。也有研究显示，转染Noxa基因的乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制和凋亡明显高于对照组，同时细胞DNA合成受到抑制，细胞周期阻滞在G0/G1期[4]。

本实验结果显示，Noxa蛋白在肝外胆管癌组织中阳性表达明显低于正常组织，这表明在肝外胆管癌组织中Noxa的活性被抑制，引起细胞凋亡与抗凋亡之间的平衡被打破，进而为肿瘤的形成提供有利条件。同时，肝外胆管癌组织中Noxa蛋白的表达与淋巴结转移、临床分期有关，而与性别、年龄、肿瘤直径、组织学分化、浸润深度及神经受累无关，因而推测，Noxa蛋白的低表达有利于癌组织淋巴结的转移，也可为评估患者的临床分期提供参考。研究结果进一步发现，阳性表达Noxa蛋白的肝外胆管癌患者5年生存率明显低于其阴性表达者，这提示Noxa蛋白表达的水平可反映患者5年生存率的状态。这也表明，通过改变Noxa蛋白表达的水平是有可能改善患者的生存预后。相关研究资料显示，一些抗肿瘤药物在神经外胚层肿瘤、前列腺癌、淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等[5-8]疾病中，以依赖p53途径或非依赖p53途径上调Noxa的表达，激活凋亡途径，进而诱导肿瘤细胞的凋亡。因而，未来有必要进一步研究Noxa蛋白在肝外胆管癌组织中表达的机制及相对敏感的抗肿瘤药物。

[1]葛贤秀,李全朋,缪林.胆管癌的治疗现状与进展[J].医学研究生学报,2012,25(5):520-523.

[2]董伟,魏志,孙自勤,等.凋亡蛋白Bad与Noxa在胃癌中表达及其与细胞凋亡的关系[J].中华实用诊断与治疗杂志,2014,28(7): 636-640.

[3]谢奇朋,叶艳,郝延璋,等.bcl-2家族BH3-only蛋白在依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡中的作用[J].肿瘤防治研究,2006,33(7): 502-505.

[4]赵志,吴爱国,沈三弟.Noxa基因转染乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制和促凋亡作用[J].肿瘤防治研究,2010,37(10):1104-1108.

[5]Armstrong JL,Veal GJ,Redfern CP,et al.Role of Noxa in p53-in-dependent fenretinide-induced apoptosis of neuroectodermal tumours [J].Apoptosis,2007,12(3):613-622.

[6]MengY,TangW,DaiY,et al.Natural BH3 mimetic(-)-gossypolchemosensitizes human prostate cancer via Bcl-xL inhibition ac-companied by increase of Puma and Noxa[J].Mol Cancer Ther,2008,7(7): 2192-2202.

[7]Perez-Galan P,Roue G,Villamor N,et al.TheBH3-mimeticGX15-070 synergizes with bortezomib inmantle cell lymphoma by enhancing Noxa-mediated activation of Bak[J].Blood,2007,109(10): 4441-4449.

[8]Inoue S,Riley J,Gant TW,et al.Apoptosis induced by histonedeacetylase inhibitors in leukemic cells is mediated by Bim and Noxa[J]. Leukemia,2007,21(8):1773-1782.

Expression of Noxa protein in extrahepatic bile duct carcinoma and its relationship with clinicopathological factors.

HU Hai-xia,LI Wei,XIONG Zheng-wen,LI Hong-wei,HUANG Yong,NIU Xiao-dong.Department of Pathology, the 251thHospital of Chinese People's Liberation Army,Zhangjiakou 075000,Hebei,CHINA

Objective To study the expression of Noxa protein in extrahepatic bile duct carcinoma and normal tissue,and investigate its relationship with clinicopathological factors.MethodsThe expression of Noxa was detected in 70 cases of extrahepatic bile duct carcinoma and 70 cases of normal tissue from March 2006 to June 2009 by immunohistochemisty(EnVisionTM).ResultsThe positive expression rate of Noxa in extrahepatic bile duct carcinoma and normal tissue was 32.86%(23/70),68.57%(48/70),respectively,with statistically significant difference(χ2=17.86,P＜0.01).The positive expression of Noxa protein in extrahepatic bile duct carcinoma tissue was related to TNM staging,lymphaden metastasis(P＜0.05),but not to gender,age,tumor diameter,histological differentiation,infiltrating depth and infiltrating nerve (P＞0.05).The five-year survival rate of patients with positive expression of Noxa was significantly lower than that of patients with negative expression[26.09%(6/23)vs 53.19%(25/47),χ2=4.59,P＜0.05].ConclusionThe low expression of Noxa in extrahepatic bile duct carcinoma not only indicates the abnormal promoting apoptosis of carcinoma cell,but also is useful for forecasting lymphaden metastasis and TNM staging,which can be used as reference index for judging patients prognosis.

Extrahepatic bile duct carcinoma;Noxa protein;Clinicopathology;Expression

R735.8

A

1003—6350（2016）05—0709—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.05.007

2015-09-07)

李伟。E-mail：liwei-324@163.com