肥大细胞及IL-33/ST2在复发性自然流产小鼠模型中的作用初探

罗金，刘雪丽，王雅琴，杨菁，徐望明

(武汉大学人民医院生殖医学中心，武汉　430060)



肥大细胞及IL-33/ST2在复发性自然流产小鼠模型中的作用初探

罗金，刘雪丽，王雅琴，杨菁*，徐望明

(武汉大学人民医院生殖医学中心，武汉430060)

【摘要】目的探讨复发性流产小鼠子宫和胎盘组织中肥大细胞的数量及白细胞介素-33(IL-33)/ST2的表达变化。方法20只雌性CBA/J小鼠随机分为两组，每组10只，分别与雄性DBA/2和Balb/c小鼠按雌雄比例2：1合笼交配，建立正常妊娠组(CBA/J♀×Balb/c/2♂)和自然流产组(CBA/J♀×DBA/2♂)模型。妊娠第13.5天处死各组雌性小鼠，计数存活胚胎数和丢失胚胎数，计算胚胎丢失率。甲苯胺蓝染色法检测小鼠子宫组织中肥大细胞的数量。ELISA检测血清中干扰素-γ(IFN-γ)、IL-4的浓度，qRT-PCR和Western-blotting分别检测胎盘组织中IL-4、IFN-γ、IL-33、ST2的mRNA和蛋白表达水平。结果成功构建了复发性自然流产(RSA)的小鼠模型，RSA模型组胚胎丢失率显著高于正常妊娠组(16.2% vs. 4.92%，P<0.05)；RSA组子宫组织中肥大细胞数显著低于正常妊娠组[(1.50±0.83)vs.(3.35±1.63)个](P<0.05)；ELISA结果显示，与正常妊娠组相比，RSA组小鼠血清中IFN-γ水平显著升高[(346.79±4.34)vs.(168.84±2.35)ng/L]，IL-4水平显著降低[(98.46±5.81)vs.(157.56±9.35)ng/L](P均<0.05)；qRT-PCR和Western-blotting结果显示RSA组小鼠胎盘组织中IFN-γ表达水平显著升高，IL-4、IL-33、ST2表达水平显著降低(P<0.05)。结论肥大细胞和IL-33/ST2可能参与了RSA小鼠体内Th1/Th2的调节，有助于妊娠的维持。

【关键词】肥大细胞；IL-33；ST2；复发性自然流产；Th1/Th2

(JReprodMed2016，25(2)：154-159)

复发性自然流产(RSA)是指连续发生2次或者2次以上由自然因素导致的妊娠不足20周、胎儿体重不足400 g而终止妊娠者[1]。正常妇女RSA的发生率大约为1%～3%[2]。RSA病因复杂，包括解剖异常、夫妻或胚胎染色体异常、内分泌异常、感染和免疫等，但具体的发病机制尚不明确。多项研究证实，Th1/Th2型细胞因子的平衡对正常妊娠的维持有着非常重要的作用[3-7]，近年来有研究显示白细胞介素-33(IL-33)/ST2信号通路在炎症与自身免疫性疾病尤其是Th1/Th2失调免疫性疾病过程中起着关键性的作用[8-10]。另有研究表明肥大细胞(MCs)与子宫局部的免疫功能调节有关，并参与胎盘的发育和妊娠分娩等过程[11-12]，且在小鼠妊娠中晚期，MCs是胎鼠血液中唯一高表达T1/ST2受体的细胞系[13]。提示MCs和IL-33/ST2可能在妊娠过程中起着重要作用。本研究采用小鼠RSA模型，观察MCs数量和IL-33/ST2表达在自然流产小鼠子宫和胎盘组织中的变化，探讨其在RSA发生过程中的作用及其对妊娠结局的影响。

材料和方法

一、材料

1. 实验动物：健康雌性CBA/J小鼠(20只)、雄性DBA/2小鼠(5只)购自北京华阜康生物科技股份有限公司，雄性Balb/c小鼠(5只)购自湖北省疾病预防控制中心。所有动物均是SPF级，8周龄，雌性小鼠体重18～21 g，雄性小鼠体重19～23 g。

2. 主要试剂：甲苯胺蓝MCs染色试剂盒购自南京建成生物工程研究所，ELISA试剂盒购自美国R&D公司，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒购自日本TaKaRa公司，多克隆IFN-γ、IL-4、IL-33和ST2抗体购自美国Santa Cruz公司。

二、研究方法

1. 自然流产动物模型的建立[14]：将雌性CBA/J小鼠随机分为两组，每组10只，分别与雄性Balb/c和DBA/2小鼠按雌雄比例2：1合笼交配，建立正常妊娠组(CBA/J♀×Balb/c♂)和自然流产模型组(CBA/J♀×DBA/2♂)。合笼后第2天早上8∶00检测雌鼠阴栓，检出阴栓者计为妊娠第0.5天，其中检出阴栓雌鼠数正常组为9只，模型组为10只。

2. 标本的收集：于妊娠第13.5天进行小鼠眼眶取血，室温静置2 h后，3 000 r/min离心30 min，取上清，0.2 ml EP管分装后-70℃冻存。眼眶取血后，颈椎脱臼法处死各组雌性小鼠，计数存活胚胎数和丢失胚胎数，并计算胚胎丢失率(R)。胚胎丢失的判断：丢失胚胎的体积明显缩小，胎儿-胎盘单位有明显的出血或坏死，胚胎组织变性或坏死。将单个胎鼠-胎盘单位连同蜕膜组织用生理盐水漂洗去掉血液后，分成两部分：一部分迅速放入液氮中，约0.5 h后转移至超低温冰箱-70℃保存；另一部分置于4%多聚甲醛中固定24 h后行MCs染色。

3. MCs计数：采用甲苯胺蓝染色法对组织进行染色，操作步骤按试剂盒说明书进行。在高倍显微镜下每张标本随机选取5个视野进行MCs计数。MCs特点：细胞体积较大，呈圆形或椭圆形，胞核较小、圆形，胞质内有粗大异染性颗粒。

4. ELISA检测：按照ELISA说明书操作步骤检测小鼠血清中IFN-γ、IL-4的浓度。每孔加入100 μl样本或标准液，以只加入稀释缓冲液的作为空白对照。

5. qRT-PCR检测胎盘组织IFN-γ、IL-4、IL-33、ST2 mRNA的表达：提取胎盘组织总RNA，逆转录成cDNA，以cDNA为模板，扩增IFN-γ、IL-4、IL-33及ST2序列。引物序列见表1。PCR反应体系总体积20 μl，其中2×SYBR Premix Ex TapTM 10 μl，2.5 μmol/L引物2 μl(上下游各1 μl)，50×ROX Reference DyeⅡ 0.4 μl，cDNA temples 1 μl，dH2O 6.6 μl。设置反应条件为：95℃ 30 s预变性，95℃ 5 s，60℃ 34 s，60℃ 60 s，共40个循环；60℃ 34 s收集荧光信号。基因表达的相对变化采用2-△△Ct法处理。

表1　qRT-PCR引物序列

6. Western-blotting检测胎盘组织中IFN-γ、IL-4、IL-33、ST2蛋白的表达：将胎盘组织用适量RIPA裂解液裂解后，测蛋白浓度，各样品取50 μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，室温下60V恒压电泳至溴酚蓝跑出浓缩胶时，将电压提高至110V后恒压电泳至溴酚蓝刚好跑出分离胶底部。电泳结束后，将凝胶上的蛋白转到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶的TBST液37℃封闭2 h，加入封闭液稀释的一抗(稀释倍数分别为：IFN-γ 1∶500，IL-4 1∶400，IL-33 1∶200，ST2 1∶200，GAPDH 1∶800)，4℃孵育过夜；TBST洗膜3次，每次10 min，再加人HRP标记的相应二抗室温反应1 h，TBST洗膜3次，化学发光(ECL)试剂盒常规发光显影洗片。采用BandScan软件分析胶片条带灰度值。

三、统计学方法

结果

一、两组胚胎丢失情况比较

RSA模型组和正常妊娠组孕鼠胚胎丢失情况见表2，模型组胚胎丢失率显著高于正常组(P<0.05)，说明RSA模型构建成功。

表2　两组孕鼠胚胎丢失情况比较 (n，%)

注：与正常组比较，*P<0.05

二、两组MCs计数情况比较

孕鼠子宫中的MCs主要分布在肌层，RSA模型组MCs数量较正常妊娠组显著减少(P<0.05)(表3)，且RSA模型组MCs脱颗粒现象较严重，体积变小，部分MCs中央呈空泡状(图1)。

表3　两组孕鼠子宫中MCs计数情况 (x-±s)

注：与正常组比较，*P<0.05

A：正常妊娠组　B：RSA模型组。箭头所指为肥大细胞图1　孕鼠子宫中MCs分布 HE染色，×400

三、两组小鼠血清中IFN-γ、IL-4水平比较

ELISA法检测各组小鼠血清中IFN-γ、IL-4水平，结果显示，与正常组相比，RSA模型组IL-4水平显著下降(P<0.01)，IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4比值显著上升(P<0.01)(表4)。

表4　两组小鼠血清IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4比较 (x-±s)

注：与正常组比较，*P<0.05

四、两组小鼠胎盘组织中IFN-γ、IL-4、IL-33、ST2的mRNA及蛋白表达水平

qRT-PCR法检测胎盘组织中IFN-γ、IL-4、IL-33和ST2的 mRNA表达，结果显示，与正常组相比，经β-actin内参校正后，RSA模型组IFN-γ mRNA水平显著增高(P<0.01)，而IL-4、IL-33和ST2 mRNA水平显著降低(P<0.01)(图2)。Western-blotting法检测胎盘组织中IFN-γ、IL-4、IL-33和ST2蛋白表达水平，其结果与mRNA表达变化一致，经GAPDH内参校正后，与正常组相比，RSA模型组IFN-γ蛋白表达显著增高(P<0.01)，而IL-4和IL-33、ST2蛋白表达显著降低(P<0.01)(图3A、B)。

注：与正常组比较，#P<0.01图2　两组小鼠胎盘组织中IFN-γ、IL-4、IL-33和ST2 mRNA的相对表达情况

A：Western-blotting图　　　　　　　　　　　　　　B：条带灰度值分析结果　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　注：与正常组比较，#P<0.01图3　两组小鼠胎盘组织中IFN-γ、IL-4、IL33和ST2蛋白表达情况

讨论

MCs是机体内重要的免疫细胞，来源于骨髓CD34+造血干细胞，能通过血液运输到达机体的各个部位并分化成熟。它与子宫局部的免疫功能调节有关，研究显示MCs及其产物可通过调节滋养层细胞的入侵和生长，参与胎盘的发育[11]，它还可释放组织胺、HT、5-HT、PGF-2α等介质，通过直接或间接的作用引发子宫收缩，参与分娩过程[12]。IL-33是IL-1家族成员之一，ST2为其特异性受体。体外实验发现，IL-33与MCs表面受体结合后可促进人CD34+MCs前体的成熟，诱导小鼠骨髓衍生肥大细胞(BMCMC)以不依赖IgE的方式释放IL-13、IL-16，在没有IgE存在时，高浓度的IL-33能延长BMCMC的存活时间[13]。此外，Moritz等[15]对小鼠的研究表明，MCs是妊娠中晚期胎鼠血液中唯一高表达T1/ST2受体的细胞系，提示IL-33在MCs的发育过程中起着重要作用。IL-33与ST2结合后，可以通过下游信号分子髓样分化因子88(MYD88)、IL-1相关蛋白激酶(IRAK)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，使NF-kB和MAPK激活，其中包括位点特异的NF-kB抑制蛋白a(IkBa)、细胞外信号调节的蛋白激酶1/2(Erk1/2)、c-Jun N端激酶(JNK)、p38 MAPK等激酶的磷酸化，从而调节基因的转录，诱导Th2型细胞因子和趋化因子的分泌，增强Th2型炎症细胞的募集[16]。由于妊娠是以Th2型细胞因子为主的免疫应答，而RSA表现为以Th1型细胞因子为主的Th1/Th2失衡[3-7，17]，因此，我们推测子宫环境中的IL-33和MCs T1/ST2在妊娠相关性疾病尤其是RSA的发病过程中起着非常重要的作用。

本研究中，我们首先采用雌性CBA/J小鼠×雄性DBA/2小鼠建立RSA模型。该模型与人类RSA具有很多的共同点，是用于研究RSA的理想模型之一[14]。研究结果显示RSA模型组雌性孕鼠的胚胎丢失率(16.20%)显著高于正常妊娠组(4.94%)，且与正常妊娠组相比，RSA模型组Th1型细胞因子IFN-γ水平显著增高，Th2型细胞因子IL-4显著降低，说明本研究中RSA小鼠模型构建成功，进一步证实了CBA/J×DBA/2小鼠模型胚胎的丢失可能与Th1、Th2细胞因子水平失衡有关。本研究发现RSA组小鼠子宫中MCs数量显著低于正常妊娠组，提示妊娠期子宫组织中的MCs有利于妊娠的维持。有研究显示MCs能合成并分泌一氧化氮(NO)，而NO能抑制妊娠子宫平滑肌的收缩，从而使胎儿获得一个安全的生存发育环境[18]。还有研究发现MCs产生的组织胺可增强滋养层细胞整合素αvβ3的表达[19]，与H1受体结合后抑制滋养细胞的凋亡[20]，并诱导Th2细胞因子的释放[21]。然而杨林松等[22]对不同时期自然流产(孕7、8、16、17 d)小鼠子宫中MCs数量进行研究发现，不同孕期自然流产小鼠子宫中MCs数量无显著差异，但是自然流产组MCs数量明显多于同期正常妊娠小鼠子宫中的MCs数量。张文学等[23]研究发现整个妊娠期间小鼠子宫中MCs数量呈现由多到少再由少到多的动态变化，子宫中MCs在胚泡植入时(孕5 d左右)数量最少。出现这种结果不一致的原因可能与染色方法和采用的自然流产动物模型不同有关。MCs在人类自然流产过程中的表达变化及其作用机制还需要进一步的研究。此外，本研究结果发现，IL-33/ST2表达水平与MCs数量变化一致，进一步说明了IL-33可能在MCs的发育成熟过程中起着重要作用。RSA模型组小鼠胎盘组织中IL-33/ST2表达水平也均低于正常妊娠组，提示RSA中Th1/Th2的失衡可能与MCs和IL-33/ST2的调节有关。

本研究初步探讨了RSA模型小鼠子宫和胎盘组织中MCs数量和IL33/ST2表达的变化，研究结果提示MCs和IL33/ST2可能参与RSA中Th1/Th2的调节，有助于妊娠的维持，但是其具体的作用机制及影响的信号通路还有待进一步研究。

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[编辑：辛玲]

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本刊编辑部

Preliminary study on role of mast cells and IL-33/ST2 in mouse with recurrent spontaneous abortion

LUOJin，LIUXue-li，WANGYa-qin，YANGJing*，XUWang-ming

ReproductiveMedicalCenter，RenminHospitalofWuhanUniversity，WuHan430060

【Abstract】

Objective： To investigate amount of mast cells and expressions of IL-33 & ST2 in uterine and placental tissue of mice with recurrent spontaneous abortion (RSA).

Methods： Twenty female CBA/J mice were randomly divided into 2 groups，10 for each group. Then the female mice of each group mated respectively with male CBA/J×BALB/c or CBA/J×DBA/2 to establish normal pregnancy group (CBA/J♀×Balb/c/2♂) or RSA model (CBA/J♀×DBA/2♂). The numbers of viable and reabsorbed embryos in each group were counted at 13.5 days of gestation. The number of mast cells in mouse uterus tissue was counted using toluidine blue staining. Expressions of IFN-γ，IL-4，IL-33 and ST2 in serum or deciduas were assessed by ELISA，qRT-PCR and Western blot respectively.

Results： A RSA mouse model was successfully established. The embryo absorption rate in RSA group was significantly higher than that in normal pregnancy group (16.2% vs. 4.92%，P<0.05). The number of mast cells in RSA group was significantly lower than that in normal pregnancy group [(1.50±0.83) vs. (3.35±1.63)，P<0.05]. Compared with the mice in normal pregnancy group，RSA model mice revealed elevated serum IFN-γ [(346.79±4.34) vs. (168.84±2.35)，P<0.05] and depressed serum IL-4 [(98.46±5.81) vs. (157.56±9.35)，P<0.05]. The qRT-PCR and Western blot results showed that IFN-γ levels in RSA group was significantly higher，but IL-4，IL-33 and ST2 levels were significantly lower than those in normal pregnancy group(P<0.05).

Conclusions： Mast cells and IL-33/ST2 may be involved in the regulation of Th1/Th2，which may be helpful to maintain pregnancy.

Key words：Mast cell；IL-33；ST2；Recurrent spontaneous abortion；Th1/Th2

【作者简介】罗金，女，湖北天门人，博士，生殖医学专业.(*通讯作者，Email：dryangqing@hotmail.com)

【基金项目】中央高校基本科研业务费专项(No. 2042015kf0137)

【收稿日期】2015-06-27；【修回日期】2015-08-26

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.2.010