泥鳅二倍体和四倍体及其正反交F1的胚胎发育特征观察

王雨辰， 练青平， 李 倩， 刘士力， 宓国强， 胡廷尖

(浙江省淡水水产研究所， 浙江 湖州 313001)

泥鳅二倍体和四倍体及其正反交F1的胚胎发育特征观察

王雨辰， 练青平， 李 倩， 刘士力， 宓国强， 胡廷尖*

(浙江省淡水水产研究所， 浙江 湖州 313001)

为泥鳅多倍体育种及新品种的培育提供参考，在水温为(26±0.5)℃条件下，对泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)二倍体、四倍体及其正反交F1的胚胎发育过程及发育特征进行观察比较。结果表明:二倍体、四倍体、正交F1和反交F1受精卵分别经过26.18 h、25.78 h、26.52 h和26.72 h孵化出膜，其发育过程和发育时序基本相同，受精发育经过卵裂前期、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、器官形成期、孵化出膜期等阶段，各发育分期除发育时间不同外，其发育特征和发育分期没有明显差异。二倍体、四倍体初孵仔鱼体长分别为(2.56±0.121)mm和(3.145±0.277)mm,仔鱼形态差别不大；正交F1仔鱼和二倍体仔鱼的形态特征基本相同，反交F1和四倍体仔鱼基本相同。

泥鳅； 二倍体； 四倍体； 正反交； 胚胎发育

泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)隶属于鲤形目(Cypriniformes)、鳅科(Cobitidae)、花鳅亚科(Cobitinae)、泥鳅属(Misgurnus)[1]，其广泛分布于我国各水系及附属水域，栖息于稻田、河沟和池塘的底层，体型小，数量多，其肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富，具有一定的经济价值，素有“水中人参”的美誉[2]。近年来，由于捕捞强度过大和自然环境的恶化，泥鳅自然野生资源不断减少，在全国掀起了养殖泥鳅热潮，虽然商品泥鳅的养殖取得了一定成功，但是泥鳅的苗种培育技术一直难以达到泥鳅产业化生产要求。目前，有关泥鳅的研究主要在生物学特性、早期胚胎发育、人工繁殖技术、养殖技术、多倍体育种和遗传基因等方面[3-18]，而有关泥鳅多倍体杂交育种及胚胎发育方面的研究鲜见报道。为探明泥鳅多倍体育种技术的可行性，笔者进行了泥鳅正常二倍体和四倍体的杂交研究，同时对二倍体、四倍体和正反交F1的胚胎发育进行观察，比较其胚胎发育差异，以期为泥鳅的多倍体育种及新品种的培育提供参考。

1 材料与方法

1.1 亲鱼培育

二倍体泥鳅为购自浙江德清钟管镇附近河道的野生泥鳅，规格为15～20 g/尾；四倍体泥鳅为采集自湖北长湖荆州段的野生泥鳅，规格为15～20 g/尾，均为2龄以上。

1.2 受精卵的获得及孵化条件

2014年6月5—6日选取性腺成熟度好，黏液较多，健壮、体表无伤的试验泥鳅，采用绒毛膜促性腺激素(HCG)、促黄体素释放激素类似物(LHRH-A2)和地欧酮(DOM)在浓度为7‰的生理盐水中混合溶解制成催产试剂，进行人工催情。雌鳅每尾一次性注射0.5 mL，雄鳅剂量减半，后放入聚乙烯网箱中，用微流水进行刺激。待效应时间到达后，采用常规人工干法授精分别获得二倍体、四倍体及二倍体和四倍体正反交F1的受精卵，分别将受精卵放入孵化桶中孵化，利用加热棒控制水温在(26.5±0.5)℃。

1.3 胚胎发育观察

受精卵受精后在体视显微镜下对胚胎发育过程进行连续观察，每次取50粒受精卵，以50%以上受精卵进入某个期记作该期的发育时间，并用CCD进行拍照。同时，胚胎每进入一个新的发育时期，取部分受精卵并用5%甲醛溶液进行固定，以便日后复查。

2 结果与分析

2.1 不同时序胚胎发育特征

水温在(26.5±0.5)℃条件下，二倍体、四倍体、正交F1和反交F1受精卵分别经过26.18 h、25.78 h、26.52 h和26.72 h孵化出膜(表1)。根据胚胎发育特征，将泥鳅二倍体、四倍体和正反交F1的受精卵胚胎发育分为7个发育阶段和26个发育分期，其发育分期的基本形态相似。

表 试验泥鳅的胚胎发育时序

2.1.1 卵裂前期 二倍体和四倍体泥鳅受精卵为球形，卵膜透明，金黄色，微粘性(图版-1、2)。正交F1和二倍体的受精卵大小一致，为(1.023±0.411)mm(图版-3)。反交F1和四倍体的受精卵大小一致，为(1.35±0.037)mm(图版-4)。受精卵的原生质由植物极向动物极流动，并在动物极形成隆起，形状似盘，此时进入胚盘期(图版-5)。该阶段各组胚胎发育形态相似，但是其发育速度不同，发育速度次序为四倍体>二倍体>反交F1>正交F1。

2.1.2 卵裂期 四倍体泥鳅受精卵受精后29 min开始卵裂，胚盘分裂成2个大小相等的分裂球，此后继续分裂进入4细胞期、8细胞期、16细胞期、32细胞期、64细胞期(图版-6～10)，随着细胞继续分裂，分裂球分裂越来越小，细胞分裂形状似桑椹状，此时进入桑椹期(图版-11)。在此发育期内，胚胎发育形态上差异不大，但时间有所区别，二倍体发育速度相对快，发育速度次序为二倍体>反交F1>正交F1>四倍体。

2.1.3 囊胚期 随着细胞分裂继续进行，细胞界线不清晰，在动物极形成囊胚层被高高举起，形似帽状，此时进入高囊胚期(图版-12)。后囊胚层的高度下降，细胞分裂进一步变小，此时进入低囊胚期(图版-13)。此期形态相似，发育时间不同，发育速度次序为二倍体>四倍体>反交F1>正交F1。

2.1.4 原肠胚期 按胚层下包的状态分为早、中、晚3期。当囊胚层下包1/3～1/2时，出现胚环，此时进入原肠早期(图版-14、15)。当囊胚层下包达2/3时，出现胚盾，即进入原肠中期(图版-16、17)。当囊胚层下包达3/4时，此时进入原肠晚期(图版-18)。此期发育速度次序为二倍体>四倍体>正交F1>反交F1。

2.1.5 神经胚期 当囊胚层下包达4/5时，神经板形成，胚环一端膨大为头部，即进入神经胚期(图版-19)。当胚层几乎包裹住整个卵黄时，胚孔关闭，胚体雏形形成，胚体侧卧，此时进入胚孔封闭期(图版-20)。此期发育速度次序为正交F1>二倍体>四倍体>反交F1。

2.1.6 器官形成期 在胚体中部出现肌节3～4对，同时头部稍隆起，此时进入肌节出现期(图版-21、22)。在胚体前端出现1对肾形突起(眼原基)，肌节出现6～7对，此时进入眼基出现期(图版-23)。在胚体前端，出现长椭圆形且透明的眼囊，肌节出现8～9对，脑可分为前中后3部分，此时进入眼囊期(图版-24)。胚体尾部变圆，呈圆锥状，出现雏形尾芽，肌节出现12～15对，此时进入尾芽期(图版-25、26)。在后脑部出现泡状耳囊，此时进入耳囊出现期(图版-27)。随着胚体的不断发育，在胚体尾部出现尾鳍雏形，卵黄出现内凹，胚体发育达卵黄囊5/6周，此时进入尾鳍出现期(图版-28)。在胚体眼囊内出现圆形晶体，肌节为20～21对，即进入晶体出现期(图版-29)。胚体出现微弱的肌肉收缩，胚体扭动次数为3～4次/min，卵黄囊内凹更加明显，此时进入肌肉效应期(图版-30、31)。在耳囊内出现两粒黑色耳石，此时胚体发育伸长，约绕卵黄囊达1周以上，尾鳍较明显，此时进入耳石出现期(图版-32、33)。此期发育速度次序为四倍体>二倍体>正交F1>反交F1。

2.1.7 孵化出膜期 胚体发育继续伸长，胚体在膜内扭动次数增加，胚体扭动次数为7次/min，眼晶体明显，此时进入出膜前期(图版-34)。随着胚胎的扭动次数逐渐增加，处在此阶段的胚胎随时可能出膜，以尾部先冲破卵膜或者头部冲破卵膜的形式出膜，此时进入出膜期。此期发育速度次序为四倍体>二倍体>正交F1>反交F1。

注:1为二倍体受精卵，2、3分别为正交和反交F1受精卵，4为四倍体受精卵，5～10分别为正交F1的胚盘期、2细胞期、4细胞期、8细胞期、16细胞期和32细胞期，11～13分别为二倍体桑椹期、高囊胚期和低囊胚期，14、15分别为正交和反交F1原肠早期，16、17分别为反交和正交F1原肠中期，18为反交F1原肠晚期，19、20分别为四倍体神经胚期和胚孔封闭期，21、22分别为正交和反交F1肌节出现期，23～25分别为正交F1眼基出现期、眼囊期和尾芽期，26～28分别为反交F1尾芽期、耳囊出现期和尾鳍出现期，29为四倍体晶体出现期，30为反交F1肌肉效应期，31为四倍体肌肉效应期，32、33分别为正交和反交F1耳石出现期，34为正交F1出膜前期，35为二倍体初孵仔鱼，36、37分别为正交和反交F1初孵仔鱼，38为四倍体初孵仔鱼。

Note:1,fertilized egg of diploid; 2 and 3.fertilized eggs of F1in reciprocal crosses; 4, fertilized egg; 5～10, blastoderm, 2-cell stage, 4-cell stage, 8-cell stage, 16-cell stage and 32-cell stage of F1in reciprocal crosses; 11～13, morula stage, early blastula stage and late blastula stage of diploid; 14 and 15, early gastrula stage of F1in positive and reciprocal crosses; 16 and 17, mid gastrula stage of F1in positive and reciprocal crosses; 18, late gastrula stage of F1in reciprocal cross; 19 and 20, neurula stage and blastopore closing stage of tetraploid; 21 and 22, myomere formation stage of F1in reciprocal crosses; 23～25, optic rudiment stage, eyesac formation stage and tail bud stage of F1in positive cross; 26～28, tail bud stage, oyocyst stage and rudiment of tail stage of F1in reciprocal crosses; 29, eye lens formation stage of tetraploid; 30, muscular contraction stage of F1in reciprocal cross; 31, muscular contraction stage of tetraploid; 32 and 33, otolithes formation stage of F1in reciprocal crosses; 34, pre-hatching stage of F1in positive cross; 35, newly hatched larvae of diploid; 36 and 37, newly hatched larvae of F1in reciprocal crosses; 38, newly hatched larvae of tetraploid.

图版 二倍体、四倍体及其正反交F1的胚胎发育过程

Fig The embryonic development process of diploid, tetraploid and their F1in reciprocal crosses inM.anguillicaudatus

2.2 初孵仔鱼形态特征及活动情况

二倍体初孵仔鱼体透明且无色素，全长(2.528±0.195)mm，体长(2.56±0.121)mm，卵黄囊前部为椭圆形，后部为棒状，无油球。仔鱼(图版-35)游泳能力不强，偶尔作间隙扭动或者向前串动，大部分时间为贴壁休息或者静卧水底，很少游动。四倍体初孵仔鱼(图版-38)与二倍体仔鱼形态上差别不大，鱼体透明无色素，全长为(3.188±0.248)mm，体长为(3.145±0.277)mm，卵黄囊同二倍体初孵仔鱼，但是大小有差别。正交F1仔鱼(图版-36)和二倍体仔鱼的形态特征基本相同，反交F1(图版-37)和四倍体仔鱼的形态特征基本相同。

3 结论与讨论

有研究表明，在一定温度范围内鱼类胚胎发育的时间与孵化温度呈负相关[19]；泥鳅胚胎在水温24.5～27.5℃条件下，经过31 h仔鱼出膜[6]；在水温19.5～23℃条件下，泥鳅多数受精卵经26.67 h孵化出膜[7]，泥鳅胚胎在19～23℃条件下，经过34 h发育出膜[8]。研究结果表明，孵化水温在(26.5±0.5)℃条件下，泥鳅二倍体、四倍体、正交F1和反交F1受精卵分别经过26.18 h、25.78 h、26.52 h和26.72 h孵化出膜。表明，泥鳅在不同温度下的胚胎发育时间呈现一定差异，与上述温度相比符合孵化温度与胚胎发育时间呈负相关的关系。

有研究表明，母本的遗传物质对后代影响力比较大，杂交后代性状一般偏向于母本，而胚胎发育方面也所体现。如翘嘴鳜和斑鳜杂交子一代[20-21]、花鱼骨和唇鱼骨杂交子一代[22-23]的胚胎发育形态和时序都偏向于母本。唇鱼骨和花鱼骨杂交F1的形态偏向于作为母本的唇鱼骨[24]，翘嘴鳜和斑鳜杂交后代的胚胎发育时序以母本为基准[25]。本研究结果与上述研究结果吻合，即正反交F1的胚胎发育时序偏向于母本。

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(责任编辑： 冯 卫)

Observation of Embryonic Development Characteristics of Diploid, Tetraploid and Their F1in Reciprocal Crosses inMisgurnusanguillicaudatus

WANG Yuchen, LIAN Qingping, LI Qian, LIU Shili, MI Guoqiang, HU Tingjian*

(ZhejiangInstituteofFreshwaterFisheries,Huzhou,Zhejiang313001,China)

The embryonic development process and characteristics of diploid, tetraploid and their F1in reciprocal crosses inM.anguillicaudatuswere observed and compared at water temperature of (26 0.5)℃ to provide a reference for polyploidy breeding and new variety breeding ofM.anguillicaudatus. Results: The hatching time of fertilized eggs of diploid, tetraploid, positive cross F1and reciprocal cross F1is 26.18 h, 25.78 h, 26.52 h and 26.72 h respectively and their development process and development time sequence are the same basically. The fertilization and embryonic development process of diploid, tetraploid, positive cross F1and reciprocal cross F1includes early cleavage stage, cleavage stage, blastula stage, gastrula stage, neurula stage, organ formulation stage and hatching stage and there are no obvious differences in the development characteristics and stages among diploid, tetraploid, positive cross F1and reciprocal cross F1except different time in development stages. The body length of diploid and tetraploid newly hatched larvae is (2.56 0.121) mm and (3.145 0.277) mm respectively, which indicates that there is no obvious difference in newly hatched larvae between diploid and tetraploid.The morphological characteristics of larva fish of positive cross F1is similar to diploid larva fish but the morphological characteristics of larva fish of reciprocal cross F1is similar to tetraploid larva fish.

Misgurnusanguillicaudatus; diploid; tetraploid; reciprocal cross; embryonic development

2015-07-20； 2015-12-24修回

浙江省公益技术研究农业项目(2012C22059，2010C32033)

王雨辰(1982-)，男，工程师，从事鱼类遗传育种和养殖技术研究。E-mail：faywallace@163.com

*通迅作者：胡廷尖 (1961-)，男，教授级高级工程师，从事鱼类遗传育种与生态养殖研究。E-mail：zjscmz@163.com

1001-3601(2016)01-0032-0121-04

S917

A