纳豆芽孢杆菌代谢产γ-聚谷氨酸液体发酵中试研究

陈卫锋，秦 涛，刘成更，李文孝，马 齐

（1.陕西省科学院酶工程研究所，陕西西安 710600；2.西北生物农业中心，陕西西安 710043）

纳豆芽孢杆菌代谢产γ-聚谷氨酸液体发酵中试研究

陈卫锋1，秦 涛1，刘成更1，李文孝1，马 齐2

（1.陕西省科学院酶工程研究所，陕西西安 710600；2.西北生物农业中心，陕西西安 710043）

以纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）HSF1410为发酵菌株，在前期发酵条件基础上，利用10 L发酵罐优化发酵培养基和供氧条件，再进行500 L发酵罐中试试验，中试γ-聚谷氨酸最高产量达32.4 g/L。

γ-聚谷氨酸；发酵；中试生产

γ-聚谷氨酸（Poly γ-glutamic acid，γ-PGA）是由D-谷氨酸和L-谷氨酸单体以酰胺键形式缩合而成的一种氨基酸聚合物。γ-PGA具有可降解性、成膜性、保湿性、可食性等特点，在医药、环保、食品、化妆品及农业等领域具有广阔的应用前景[1-3]。

γ-PGA可以通过化学合成[4]、天然产物提取以及微生物发酵而得，微生物发酵法[5]与前2种方法相比，不仅生产成本低，而且生产过程污染小，适合大规模生产，因此采用微生物发酵法生产聚谷氨酸成为目前研究方向的主流，现在绝大多数γ-PGA产品由利用芽孢杆菌[6]发酵、提取分离得到。

试验以纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）HSF1410为生产菌株，在摇瓶发酵产γ-PGA最佳培养基和培养条件及10 L发酵罐小试的基础上，进行500 L发酵罐中试研究，确定其最适发酵工艺参数。

1 试验材料和方法

1.1 试验材料

纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）HSF1410，由陕西师范大学食品工程与营养科学学院提供；葡萄糖、酵母粉、K2HPO4，NH4Cl，MgSO4，天津市科密欧化学试剂有限公司提供。

GRJB-10D型10 L发酵罐，镇江格瑞生物工程有限公司产品；500 L发酵罐，陕西美乐设备有限公司产品；UV-2802SH型紫外可见分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司产品；NDJ-5型黏度测定仪，北京东西器材有限公司产品；S1100型高效液相色谱仪，美国Agilent公司产品。

（1）液体种子培养基。液体LB培养基，pH值7.0，于121℃条件下蒸汽灭菌20 min。

（2）原发酵培养基。葡萄糖30 g/L，NH4Cl 4 g/L，L-谷氨酸钠15 g/L，酵母粉1 g/L，K2HPO43 g/L，MgSO40.2 g/L，无水 CaCl20.2 g/L，pH值 7.0，于121℃下蒸汽灭菌20 min。

（3）优化培养基。用玉米淀粉经液化和糖化部分替代原发酵培养基中的葡萄糖，用玉米浆部分替代酵母粉，灭菌同原发酵培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 10 L发酵罐液体发酵条件的优化

（1）灭菌。采用高压蒸汽灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间20 min。

（2）接种。用氨水调节pH值至6.8左右，接入菌种，再调节pH值至7.0，接种量约为1%。

（3）培养。发酵温度28℃，风量1∶0.5，压强0.05 MPa，pH值7.0，发酵时间2 h，光密度0.35～0.50，可转入发酵。

将纳豆芽孢杆菌HSF1410接种于液体LB摇瓶种子培养基中，以转速160 r/min，温度37℃摇床培养18 h，即为种子液。按照2%的接种量接种至10 L发酵罐中，发酵培养基的装液量为55%，通气量为2 vvm，对发酵过程中的温度、转速及补料方式进行优化。整个发酵过程中，每4 h取1次样，检测发酵液中菌体生物量、聚谷氨酸合成酶活力、γ-PGA含量，以此确定最优的10 L罐发酵工艺。

1.2.2 500 L发酵罐液体发酵方法

（1）灭菌。采用高压蒸汽灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间20 min。

（2）接种。用氨水调节pH值至7.0左右，接种量约为2%。

（3）培养。发酵温度37℃，通风量、罐压和搅拌转速根据溶氧的要求调节溶氧水平。补料分批发酵时，当残糖含量低于20 g/L时补充糖液，以维持残糖含量为10～20 g/L，发酵过程中每隔4 h取样进行各种参数测定。

1.2.3 分析方法

（1）细胞生长测定。采用比浊法，以发酵培养基作为参比溶液，于波长600 nm处测定发酵液的吸光度（OD600）。

（2）发酵液中γ-PGA含量的检测[7]。按照γ-PGA的凝胶渗透色谱（GPC）检测方法分析各编号菌株发酵液中产物的浓度；采用GPC法，将发酵液稀释25倍后过0.22 μm滤膜去除菌体，用1100Series型高效液相色谱仪进行分析；TSK-gelG5000PWxl-CP型色谱柱，10 μm，7.8 mm×30 mm（TOSOH，日本）；流动相：0.015 mol/L Na2HPO4-KH2PO4，0.15 mol/L NaCl溶液，pH值7.0；流速0.4 mL/min；检测波长220 nm；γ-PGA标准品（Vedan，中国台湾）。

（3）残糖测定。采用改良裴林氏法[8]。

2 结果与讨论

2.1 发酵培养基配方优化

2.1.1 玉米淀粉添加量的优化

在前期摇瓶液化发酵得出发酵培养基配方确定葡萄糖浓度25 g/L，试验采用玉米淀粉部分替代葡萄糖进行10 L发酵罐试验。玉米淀粉按液化酶和糖化酶的使用说明经过酶水解，玉米淀粉与葡萄糖质量总计为20 g/L，玉米淀粉与葡萄糖按一定比例添加，按照接种量2%，发酵温度37℃，发酵pH值7.0，通过分批次调节通风量、罐压和搅拌转速将溶氧控制在20%～25%，发酵52～54 h，测残糖含量和γ-PGA产量。

玉米淀粉添加量对γ-PGA产量的影响见图1。

图1 玉米淀粉添加量对γ-PGA产量的影响

由图1可知，随着玉米淀粉添加量的增大，γ-PGA产量明显减少。在玉米淀粉与葡萄糖添加比例在0.25时，γ-PGA产量降低不明显，说明此发酵可以部分利用玉米淀粉水解的糖作为碳源。

玉米淀粉添加量对底物转化率的影响见表1。

表1 玉米淀粉添加量对底物转化率的影响

玉米淀粉水解后，在发酵液中也是葡萄糖，底物转化率是指γ-PGA的合成量与玉米淀粉和葡萄糖之合的比值。由表1可知，随着玉米淀粉添加比例提高，糖的底物转化率也随之下降，但是在玉米淀粉添加量为0.25 g时转化率下降不明显。更进一步证明，玉米淀粉可以部分替代葡萄糖作为碳源。

2.1.2 玉米浆添加量的确定

摇瓶发酵得出发酵培养基配方确定酵母粉2 g/L，试验采用玉米浆部分替代酵母粉进行10 L发酵罐试验。玉米浆与酵母粉按一定比例添加，接种量2%，发酵温度37℃，发酵pH值7.0，通过分批次调节通风量、罐压和搅拌转速将溶氧控制在20%～25%，发酵52～54 h，测γ-PGA产量。

玉米浆添加量对γ-PGA产量的影响见图2。

图2 玉米浆添加量对γ-PGA产量的影响

由图2可知，随着玉米浆添加量的增大，γ-PGA产量明显减少。在玉米浆与酵母粉添加比例为0.5时，γ-PGA产量降低不明显，说明此发酵可以部分利用玉米浆替代酵母粉。

2.2 分批控制溶氧10 L罐小试

在已经确定的各项发酵参数条件下，在10 L发酵罐上进行溶氧控制的研究，分别调节通气量、罐压、搅拌转速，分阶段控制溶氧参数。在延滞期（0～6 h）控制20%溶氧，在对数生长期（6～20 h）控制45%溶氧，进入稳定期（20 h以后） 控制20%溶氧。

分段控制溶氧与恒定溶氧对生物量的影响见图3。

图3 分段控制溶氧与恒定溶氧对生物量的影响

由图3可知，分段控制溶氧明显能提升发酵液生物量，菌种生长总体水平有较大幅度提高。

2.3 500 L发酵中试

分段控制溶氧与恒定溶氧对γ-PGA产量的影响见图4。

图4 分段控制溶氧与恒定溶氧对γ-PGA产量的影响

由图4可知，分段控制溶氧提高了γ-PGA的产量。

2.3 500 L罐中试放大

为了评价10 L罐发酵工艺的稳定性和可行性，在500 L罐中对发酵工艺进行放大试验。

500 L中试发酵试验见表2。

500 L罐中试产量在49～51 h达到最大，分别32.4，30.6，29.6 g/L，第3批次相对前2批次在接种时间上稍推迟，使得菌龄增长，但是仍未出对数生长期，导致菌种的生物量也相对前2批次增高，但

表2 500 L中试发酵试验

[1]Bhatt R，De Vries P，Tulinsky J，et al.Synthesis and in vivo antitumor activity of poly（L-glutamic acid） conjugates of 20S-camptothecin[J].Journal of Medicinal Chemistry，2003，46（1）：190-193.

[2]Sun M H，Park C，Kim C J，et al.Natural and ediblebiopolymer poly γ-glutamic acid：synthesis，production，and applications[J].The Chemical Record，2005（6）：352-366.

[3]鞠蕾，马霞.γ-聚谷氨酸的应用进展 [J].中国酿造，2011（9）：1-4.

[4]曹名锋，金映虹，解慧，等.聚谷氨酸的微生物合成、相关基因及应用展望 [J].微生物学通报，2011，38（3）：388-395.

[5]Yokoigawa K，Sato M，Soda K.Simple improvement in是在同样的发酵条件下，最终γ-PGA产量减少，这说明菌种过度生长会对代谢产物累积量有影响。

500 L中试放大，γ-PGA累积量3批次平均值为30.5 g/L，相对于10 L罐γ-PGA平均产量25.8 g/L提高了18.2%，这可能是由于扩大发酵体积提高了发酵液的传质效率，从而改善了微生物的生长环境，使得代谢物累积量增设。

3 结论

（1）在发酵过程中，用葡萄糖质量25%的玉米淀粉可以部分替代葡萄糖，用酵母粉质量50%的玉米浆可以部分替代酵母粉，这样产业化发酵生产可以相对控制成本。

（2）在发酵过程中采用分段控氧的供氧工艺，即通过分别调节通气量、罐压、搅拌转速，分阶段控制溶氧参数，在延滞期（0～6 h） 控制为20%溶氧，在对数生长期（6～20 h）控制为45%溶氧，进入稳定期（20 h以后）控制为20%溶氧，可以有效地提高γ-PGA发酵累积量。

（3）将10 L罐发酵工艺放大到500 L罐，发酵结果代谢产物量明显提升，证明了发酵工艺稳定可行，为γ-PGA的工业化生产奠定了基础。目前，尚无报道中试或产业化为γ-PGA发酵工艺，试验的发酵水平达到了产业化生产水平，具有良好的工业化前景。

freeze-tolerance of bakers'yeast with poly γ-glutamate[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2006（3）：215-219.

[6]程艳玲，赵玉娥，王海玉.生物降解型聚谷氨酸的研究进展 [J].北京联合大学学报（自然科学版），2008（2）：45-49.

[7]吕莹，郝紫徽，李虹.γ-聚谷氨酸的分离提纯 [J].食品与发酵工业，2005，31（2）：133-134.

[8]梁金钟，王风青．微生物发酵法合成高分子聚合物 γ-PGA的研究 [J].北京工商大学学报（自然科学版），2011，29（1）：24-29．◇

Pilot Scale Fermentation of γ-Poly Glutamic Acidby Bacillus Subtilis Natto HSF1410

CHEN Weifeng1，QIN Tao1，LIU Chenggeng1，LI Wenxiao1，MA Qi2
（1.Enzyme Engineering Research Institute of Shaanxi Academy of Sciences，Xi'an，Shaanxi 710600，China；
2.Nerthwest Bio-agriculture Ceuter，Xi'an，Shaanxi 710043，China）

Bacillus subtilis natto HSF1410 is taken as start strains for fermentation，on the basis of the early stage of the fermentation conditions，10 L fermentation tank is used to optimize the fermentation culture medium and oxygen supply conditions，then pilot production of poly γ-glutamic acid is carried out use 500 L fermentation tank，pilot γ-PGA maximum yield of 32.4 g/L.

γ-PGA；fermentation；pilot production

TQ922.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.12.031

1671-9646（2016）12b-0018-03

2016-10-12

陕西省科学院基础应用项目支持（2011K-13）；陕西省农业科技创新项目支持（2011K02-03）。

陈卫锋（1971— ），男，本科，助理研究员，研究方向为微生物菌种选育及发酵工程。