化学发光微粒子免疫法检测肉制品中的磺胺类药物残留

何 进， 李 平*， 谢体波， 党 娟， 吴紫洁， 何方洋，2

(1.贵州勤邦食品安全科学技术有限公司， 贵州 贵阳 550009； 2.北京勤邦生物技术有限公司， 北京 100012)

化学发光微粒子免疫法检测肉制品中的磺胺类药物残留

何 进1， 李 平1*， 谢体波1， 党 娟1， 吴紫洁1， 何方洋1，2

(1.贵州勤邦食品安全科学技术有限公司， 贵州 贵阳 550009； 2.北京勤邦生物技术有限公司， 北京 100012)

为快速、简便地检测到肉制品中的磺胺类药物残留，采用化学发光微粒子免疫法对鸡肉、鱼肉、虾肉中的磺胺类药物残留进行检测，并与仪器法测量结果进行比较。结果表明：化学发光微粒子免疫法的灵敏度为1 μg/kg，3类样品的最低检测限均为0.864 μg/kg。磺胺类药物的添加回收率在94.33%～104.28%，RSD在1.2%～6.5%；检测结果与仪器法一致，且具有成本低、检测快、检测批量大等优点，适用于肉制品中磺胺类药物的残留检测。

化学发光试剂盒； 磺胺； 肉制品； 残留检测

磺胺类药物(Sulfonamides，SA)是具有氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，其抗菌谱较广，对大多数革兰氏阳性菌以及阴性菌有抑制作用，具有性质稳定，品种多、价格低和使用简便等特点，被广泛应用于兽医临床和畜牧养殖业中作为饲料添加剂或动物疾病治疗药物[1]。但是人类经常食用有磺胺类药物残留的动物性食品可引起磺胺类药物在体内逐渐累积。其危害性主要表现为细菌耐药性、过敏、造血紊乱、致癌及激素样作用等[2-3]。随着社会的发展，磺胺类药物的不合理使用，使其在动物性食品中残留引起生态环境污染和危害人类健康的潜在威胁备受关注，成为人类亟待解决的问题之一，而各类检测方法也随之应运而生。

目前，磺胺类药物的检测方法主要有微生物学法、理化分析方法和免疫法等。微生物法因操作费时且灵敏度、特异性都较差，在定性定量上存在困难，不能满足现代残留检测的需要而未得到广泛应用[4]。理化法常作为确证方法检测动物组织中磺胺类药物的残留，主要有液相色谱法(HPLC)[5-7]、液相色谱串联质谱法(UPLC-MS)[8-10]等，此法虽准确、灵敏、高效，但前处理过程较繁琐，仪器较昂贵，且需专业人员来操作，故其应用也受到一定限制[11]。免疫分析法主要为酶联免疫法与化学发光微粒子免疫分析法，该法灵敏度高、操作简单、检测成本低、可批量检测，具有较好的发展前景[12]。为寻求快速、简便地检测到肉制品中的磺胺类残留物质，采用化学发光微粒子免疫法(CMIA)对肉制品中的磺胺类物质进行测定，以保障消费者免受肉制品中磺胺类药物残留的危害。

1 材料与方法

1.1 材料

磺胺化学发光微粒子免疫分析测定试剂盒(贵州勤邦生物科学技术有限公司)，磺胺类药物标准品：纯度>99.5%(美国Sigma公司),氢氧化钠(沧州众信化工有限公司),乙腈(美国spectrum公司),乙酸乙酯(苏州德荣化工)。

仪器：磁免疫全自动化学发光检测仪(德国拜耳公司)，氮吹仪(DSY-111，上海乔跃电子科技有限公司)涡旋仪(QL-901，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，均质器(CJ-04，上海丙林电子科技有限公司)，离心机(GT16—3A，北京时代北利离心机有限公司)。电子天平(AL-204，沈阳龙腾电子科技有限公司)，微量移液管(单道20～200 μL，100～1 000 μL，美国Thermo公司)，液相色谱串联质谱仪(美国安捷伦公司)。

1.2 样品前处理

鸡肉、鱼肉和虾肉，用均质器均质样本；称取(2.0±0.05)g样本于50 mL聚苯乙烯离心管中，加入3.8 mL乙腈-NaOH(0.1 mol/L)溶液，再加入2 mL乙酸乙酯，涡动混匀，室温(20～25℃)3 000 r/min离心5 min；移取3 mL上层有机相至10 mL洁净干燥玻璃管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1 mL正己烷，用涡旋仪涡动1 min，再加1 mL复溶工作液，用涡旋仪涡动1 min，室温(20～25℃)3 000 r/min，离心5 min；除去上层有机相，取下层水相用于分析。

1.3 磺胺类药物的测定

取出试剂盒内微孔板，将标准品和样品对应微孔空编号，每个标准品和样品做3孔平行，记录样品孔和标准孔位置。各微孔中分别加50 μL标准品或样品、50 μL酶标抗体和50 μL磁标抗体工作液，混匀，用盖板膜盖板后置于25℃避光反应30 min。揭开盖板膜，甩干孔内液体，按250 μL/孔加入洗涤工作液，每10 s洗涤1次，充分洗涤4～5次，用吸水纸拍干。分别按50 μL/孔加入底物A液和B液，混匀，用盖板膜盖板后置于25℃避光反应；15 min后按50 μL/孔加入终止液，混匀，设定反应杯于450 nm处且在5 min内测完OD值，并记录。

1.3.1 磺胺类药物浓度的计算 分别对0 μg/L、1 μg/L、3 μg/L、9 μg/L、27 μg/L和81 μg/L系列浓度的标准溶液进行CMIA检测，测定RLU值。以磺胺类药物浓度对数值(Log)为横坐标，各对应浓度的抑制率(RLU/RLU)为纵坐标，制作标准曲线。

1.3.3 精密度的测定 精密度又称可重复性，反映测定方法对某一特定样品多次测定所得结果的重复程度，这是评定化学发光试剂盒质量最基本的参数，常用变异系数表示。在检测为阴性的鸡肉样本中添加2 μg/L磺胺类药物，做6个平行，用试剂盒提供的操作方法提取测定，计算测定样品的变异系数。

1.3.4 样品添加回收试验 取空白鸡肉、鱼肉、虾肉样品以1 μg/L、2 μg/L和4 μg/L磺胺类药物进行添加，每种样品、每个浓度各5个平行。

1.3.5 仪器对比试验 随机采购鸡肉、鱼肉、虾肉样本各20份，分别用CMIA法和HPLC-MS/MS进行检测。仪器方法参考国标GB/T 21316—2007[14]。

1.4 结果计算

百分吸光率=B/B0×100%，式中，B为标准品或样本溶液的平均吸光度值，B0为0 μg/kg标准溶液的平均吸光度值。

将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应浓度，乘以其对应稀释倍数即为样品中磺胺类试剂的浓度。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

由图示可知，标准曲线方程为y=-40.45x+77，R2=0.993，其中磺胺类药物的IC50值为4.0 μg/L，说明磺胺类药物试剂盒的线性关系良好，可以满足残留分析的要求。

2.2 试剂盒的检测限及精密度

检测限：由表1可知，化学发光微粒子免疫法测定20次空白鸡肉磺胺类药物的平均值为0.303 μg/kg，标准差为0.187 μg/kg，最低检测限为0.864 μg/kg。

精密度：通过测定，磺胺类药物测定试剂盒的变异系数分别为2.36%、1.96%、2.54%、4.32%、3.11%、2.08%、3.68%、4.21%、2.87%、1.19%，均小于10%，说明该试剂盒重现性好，性能较为稳定，具有较好的精密度。

图示 磺胺类药物化学发光试剂盒标准曲线

Table 1 Detection results of 20 blank chicken samples of sulfonamides μg/kg

表2 化学发光微粒子免疫法测定3种肉制品中磺胺类 药物的试剂盒添加回收率

Table 2 Addition recovery of 3 meat products of SA kit by CMIA

样品名Nameofsamples添加浓度/(μg/L)Additionconcentration平均回收率/%AveragerecoveryRSD/%鸡肉1．0100．115．4 Chicken2．095．946．54．094．361．2鱼肉1．0105．143．1 Fishflesh2．097．774．24．096．583．6虾肉1．096．582．1 Shrimp2．0104．282．54．094．333．7

表3 CMIA与HPLC-MS/MS法测定肉制品中 磺胺类物质的结果

Table 3 Detection of sulfonamides in meat products by CMIA and HPLC-MS/MS

样本Samples样本号SamplenumberCMIAHPLC⁃MS/MS样本号CMIAHPLC⁃MS/MS鸡肉1--11-- Chicken2241．123512--3--13--4--14--5--15--6--16147．5144．77--17--8--18--9--19--10--20--鱼肉1--11-- Fishflesh2--12145．9140．53--13--4--14--5--15--6214．8210．51682．4807--17--8--18--9--19--10--20--虾肉1--11-- Shrimp2--12--395．190．513--4--14--5--15167．5164．86--16--7--17--887．485．918--9--19--10--20--

注：-表示未检出

Note:-,Non-detected

2.3 样品添加回收率

由表2可知，磺胺类药物在鸡肉、鱼肉、虾肉中的添加回收率在94.33%～105.14%，RSD在1.2%～6.5%，表明化学发光微粒子免疫法测定磺胺类药物的添加回收率符合我国兽药残留标准[13]。

2.4 CMIA与HPLC-MS/MS法的测定结果

由表3可知，CMIA法与仪器法测定结果一致，吻合度达到100%，说明该方法准确，适用于鸡肉、鱼肉、虾肉中磺胺类药物的残留检测。3种基质共60份样品中，检出限超过国标(50 μg/kg)的共16份，检出率为25%，表明我国磺胺类药物在动物性组织中的残留存在超标情况，虽不严重，但应引起相关职能部门的注意，做到防患于未然。

3 结论

试验采用化学发光微粒子免疫分析法对鸡肉、鱼肉、虾肉中的磺胺类药物残留进行检测，方法灵敏度为1 μg/kg，3类样品的最低检测限均为0.864 μg/kg。磺胺类药物在鸡肉中添加回收率为94.36%～100.11%，RSD为1.2%～6.5%；鱼肉中磺胺类药物添加回收率为96.58%～105.14%，RSD为3.1%～4.2%；虾肉中磺胺类药物的添加回收率为94.33%～104.28%，RSD为2.1%～3.7%。与液相色谱串联质谱相比，检测结果一致，但检测时间短、前处理简单、成本低、批次检测量大，适用于鸡肉、鱼肉和虾肉等肉制品中磺胺类药物的大批量快速检测。

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(责任编辑： 孙小岚)

Detection of Sulfonamides Residues in Meat Products by CMIA

HE Jin1, LI Ping1*, XIE Tibo1, DANG Juan1, WU Zhijie1, HE Fangyang1，2

(1.GuizhouKwinbonFoodSafetyScience&TechnologyCo.,Ltd.,Guiyang,Guizhou550009; 2.BeijingKwinbonFoodSafetyScience&TechnologyCo.,Ltd.,Beijing100012,China)

The sulfonamides residues in chicken, fish flesh and shrimp were detected by CMIA and HPLC-MS/MS respectively to rapidly and easily detect sulfonamides in meat products and guarantee consumers’ personal rights. Results:The sensitivity of CMIA is 1 μg/kg and the lowest detectable limit of chicken, fish flesh and shrimp all is 0.864 μg/kg. The addition recovery of SA is 94.33%～104.28% andRSDis 1.2%～6.5%, which is consistent with that of HPLC-MS/MS. CMIA with the advantages of low cost, rapid detection, large batch popularization potential can be suitably used in SA residue detection in meat products.

chemiluminescent kit; sulfonamides; meat product; residue detection

2016-01-11； 2016-05-04修回

2013创新人才计划项目“全自动化学发光免疫分析食品安全快速检测系统研发”[筑科合同(2013)209-01]；2014贵州省科技成果转化引导基金计划项目“动物源性食品中兽药残留酶联免疫检测产品产业化及推广应用”[黔科合成转字(2014)5104]；2015贵州省科技计划项目“农产品质量安全控制技术集成研究与应用示范”[黔科合NY(2015)3016-1]

何 进(1988-)，女，工程师，从事食品安全快速检测技术的研究与开发。E-mail: 245208083@qq.com

*通讯作者：李 平(1986-)，女，工程师，硕士，从事食品安全快速检测技术的研究与开发。E-mail：294173456@qq.com

1001-3601(2016)05-0225-0148-04

S851.34+7

A