冬竹荪多糖及氨基酸含量的测定与分析

张 恩， 杨昌贵， 江维克*， 周 涛， 肖承鸿， 张光文

(1.贵阳中医学院， 贵州 贵阳 550002； 2.贵州乌蒙腾菌业有限公司， 贵州 毕节 551660)

冬竹荪多糖及氨基酸含量的测定与分析

张 恩1， 杨昌贵1， 江维克1*， 周 涛1， 肖承鸿1， 张光文2

(1.贵阳中医学院， 贵州 贵阳 550002； 2.贵州乌蒙腾菌业有限公司， 贵州 毕节 551660)

为进一步开发利用冬竹荪，采用显色比色法、柱前衍生化-HPLC法测定冬竹荪中多糖和氨基酸的含量，并用氨基酸比值系数法评价其蛋白质营养价值。结果表明：冬竹荪中多糖含量为10.82%，冬竹荪的17种氨基酸中包含了8种必需氨基酸，氨基酸总量为8.72%，必需氨基酸总量为3.59%；必需氨基酸与氨基酸总量的百分比(E/T)为40.4%、必需氨基酸与非必需氨基酸的比值(E/N)为0.68；第一限制性氨基酸为蛋氨酸+胱氨酸，氨基酸比值系数分(SRC)为70.61。冬竹荪具有较高的营养价值，是一种极具市场和开发价值的食药两用真菌。

冬竹荪； 多糖； 氨基酸

冬竹荪(PhallusimpudicusL.)与红托竹荪(DictyophorarubrovolvataZang,Ji et Liou.)、长裙竹荪〔Dictyophoraindusia(Ven et Pers) Fisch.〕和短裙竹荪〔Dictyophoraduplicate(Bosc)Fisch.〕均是传统的食药两用真菌[1-2]。其中，竹荪品质评价、药理药效及产品研发的研究报道较多，并产生了良好的经济价值，贵州的织金县也因此被誉为中国竹荪之乡。近年来，随着同科真菌资源的开发，冬竹荪也成为人们关注的食用菌类，贵州省毕节地区成立了冬竹荪种植协会，冬竹荪的研发已变得十分紧迫。

冬竹荪为鬼笔科鬼笔属真菌白鬼笔(PhallusimpudicusL.)的子实体，又名鬼笔菌、竹下菌、竹菌、无裙荪等。冬竹荪药食两用，入药具有祛风除湿、活血止痛的功效，用于治疗风湿疼痛等症[1]，现代药理研究发现冬竹荪还含有多种抗肿瘤活性物质，有防病保健的作用[3]。作为食用菌，其滋味鲜美、口感嫩滑爽脆，还具有特异菇香，是人们喜爱的菌类食品之一。冬竹荪适宜在林下腐殖土中生长[4]，出菇温度较低，在贵州毕节地区已大面积栽培。但目前对冬竹荪的研究主要集中在栽培方法[5]和生物学特性[6]方面，尚未见对其多糖、氨基酸等有效成分或营养成分的研究报道。多糖和氨基酸是菌类食品重要的营养成分、鲜味成分，也是衡量菌类资源是否具有开发利用价值的重要指标。为进一步开发利用冬竹荪，笔者对冬竹荪的多糖和氨基酸含量进行测定与评价，为冬竹荪资源的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

冬竹荪样品：采自贵州毕节地区织金县的城关镇、官寨乡、板桥乡，经贵阳中医学院鉴定为鬼笔科白鬼笔属(PhallusimpudicusL.)的子实体。

仪器：紫外可见分光光度计(CBC-Cintra20型，澳大利亚照生公司)，高效液相色谱仪(日本岛津LC-20AD)。

试剂：葡萄糖对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110833-200904)，氨基酸测定试剂包(天津博纳艾杰尔科技有限公司，包括：三乙胺，异硫氰酸苯酯，正亮氨酸)，氨基酸标准溶液(天津博纳艾杰尔科技有限公司，含17种氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸，其中胱氨酸含量为1.25 μmol/mL，其余氨基酸含量均为2.5 μmol/mL)。

1.2 多糖测定

1) 标准曲线的制备。精密称取无水葡萄糖对照品，加蒸馏水制成浓度为0.34 mg/mL的对照品溶液，分别量取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL置于具塞试管中，加蒸馏水补足至2.0 mL，精密加入4.0%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加入5 mL浓硫酸，摇匀，放置至室温，以蒸馏水为空白，用紫外分光光度计在490 nm的波长处测定吸光度值，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得线性方程y=0.057 1x-0.013 5(R2=0.999 5)。

2) 多糖含量测定。精密称取样品粗粉1 g，加入40 mL蒸馏水，于60℃水浴加热提取2 h，取出，滤过，取药渣在相同条件下提取2 h，滤过，合并2次滤液，放冷，转移至100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，精密吸取2 mL，置于具塞试管中，按标准曲线的制备项下自“精密加入4.0%苯酚溶液1 mL”起操作，测定吸光度值，从标准曲线上查出供试品中葡萄糖的含量(μg/mL)，并计算多糖含量。

1.3 氨基酸的测定

1) 色谱条件。色谱柱：pntulipsTMQS-C18氨基酸分析专用柱(4.6×250 nm，5 μm)，以0.1 mol/L醋酸钠缓冲液(pH 5.4)-乙腈(93∶7)为流动相A，80%乙腈为流动相B，进行梯度洗脱(表1)。检测波长：254 nm；流速：1 mL/min；柱温：柱温30℃；进样量：10 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序

2) 供试液的制备。取样品粉末0.5 g，精密称定，置于水解管中，加入6 mol/L含0.1%苯酚的盐酸10 mL，融封。于(110±1)℃的恒温干燥箱内水解24 h，取出，冷却，取水解液5 mL于水浴上挥干，用水溶解，定容于5 mL容量瓶中，备用。

3) 供试液及氨基酸标准溶液的衍生。取供试液及氨基酸标准溶液各200 μL，分别加入正亮氨酸内标溶液20 μL，三乙胺乙腈溶液100 μL，异硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混匀，室温放置3 h，加入正己烷400 μL，振摇，放置10 min，取下层液，用0.45 μm滤膜滤过。取滤液200 μL加800 μL水稀释，混匀，备用。

4) 供试品测定。精密吸取制备的供试液10 μL注入高效液相色谱仪，按色谱条件项下方法进样检测，并计算氨氨基酸含量(%)=f1CV×10-6/f2W。式中，f1为样品溶液中氨基酸峰面积/内标峰面积，f2为混合氨基酸标准溶液中各氨基酸峰面积/内标峰面积，C为氨基酸对照品溶液浓度(μg/mL)，V为稀释倍数，W为样品质量(g)。

1.4 氨基酸营养价值评价

采用氨基酸比值系数法[7]计算上述样品中必需氨基酸(EAA)的氨基酸比值(RAA)，氨基酸比值系数(RC)及比值系数分(SRC)，RAA=冬竹荪必需氨基酸含量/模式谱相应氨基酸含量，RC=RAA/RAA的平均值，SRC=100-CV×100；其中RC(氨基酸比值系数)越接近1，表明该氨基酸越接近模式氨基酸，SRC(氨基酸比值系数分)越接近100，表明其营养价值越高，SRC越小营养价值越低。

2 结果与分析

2.1 冬竹荪多糖及氨基酸含量

多糖作为真菌重要的活性成分，主要存在于真菌菌丝、子实体及其发酵液中，一般是由10个以上的单糖以糖苷键连接而成的高分子聚合物[8]，在提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化活性、降血糖、抗衰老等方面具有良好的疗效[9]，其含量的高低也是衡量真菌药用价值的一项重要指标，《中国药典》2010版中就规定了灵芝的多糖含量不得低于0.5%。经测定，冬竹荪多糖含量为9.64%，明显高于常见真菌如灵芝(2.88%)[10]、香菇(6.92%)、牛肝菌(7.67)[11]的多糖含量，提示冬竹荪多糖有着很好的开发利用前景。

从表2可知，冬竹荪中含有17种氨基酸，总量为8.72%，必需氨基酸含量为3.59%；必需氨基酸占氨基酸总量比值(E/T)约为40.4%；必需氨基酸占非必需氨基酸比值(E/N)为0.68。E/T、E/N值达到了FAO/WHO提出的理想蛋白质E/T=40.0%、E/N=0.60的标准[12]。含量较高的有谷氨酸(0.94～1.14%)、天冬氨酸(0.86～0.95%)。谷氨酸是脑组织生化代谢中的首要氨基酸，参与多种生理活性物质的合成，在大脑，肝脏等组织中起解毒作用，天冬氨酸在降血压、治疗心脏病等方面有很好的疗效[13]。因此，推测经常食用冬竹荪对心脑血管系统和肝脏方面应具有良好的营养保健功效。冬竹荪中F/T(谷氨酸和天冬氨酸含量占氨基酸总量的比值)约为21.8%(≥20%)，这也是冬竹荪口感鲜美的原因。

表2 冬竹荪多糖与氨基酸的含量

注：*为必需氨基酸，E/N为必需氨基酸与非必需氨基酸含量的比值，E/T为必需氨基酸与氨基酸总量的百分比，F/T为鲜味氨基酸与氨基酸总量的百分比。

Note:*, essential amino-acid; E/N, The ratio of essential amino acids to non-essential amino acid content; E/T, The ratio of the total amino acid to essential amino acid; F/T, The percentage of the total amino acid to flavor amino acid.

2.2 冬竹荪的氨基酸评价

蛋白质营养价值的评价有生物价、蛋白质功效比值、氨基酸评分法和氨基酸比值系数法等，氨基酸比值系数法是根据氨基酸平衡理论，利用FAO/WHO的氨基酸模式进行蛋白质质量评价[7]。通过氨基酸比值系数法对冬竹荪营养价值进行评价显示(表3)，冬竹荪中第一限制性氨基酸为蛋氨酸+半胱氨酸(RC=0.54)，其他氨基酸含量与模式氨基酸含量相当，尤其是苏氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸的含量较高(RC=1.43)，若将冬竹荪与富含蛋氨酸+半胱氨酸的食品一起食用，或与缺乏苏氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸的食品一起食用，可以实现营养平衡，或提高食品营养价值。另外，冬竹荪的SRC值为70.61，高于樟芝(42.08)、灵芝(51.83)[14]和黑木耳(66.65)[15]等常见真菌的SRC值，表明冬竹荪有着较高营养价值。

表3 冬竹荪氨基酸的RAA、RC和SRC值

3 结论

冬竹荪含有较丰富的多糖和氨基酸，其氨基酸种类齐全，E/T和E/N分别为40.4%和0.68，达到FAO/WHO提出的理想蛋白质的标准，是较为理想的优质蛋白质来源；冬竹荪第一限制性氨基酸是蛋氨酸+半胱氨酸，氨基酸比值系数为70.61，具有较高的营养价值，是一种极具市场和开发价值的食药两用真菌。

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(责任编辑： 孙小岚)

Determination and Analysis of Polysaccharide and Amino Acid inPhallusimpudicus

ZHANG En1, YANG Changgui1, JIANG Weike1*, ZHOU Tao1, XIAO Chenghong1,ZHANG Guangwen2

(1.GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang,Guizhou550002； 2.GuizhouWumengtengFungusIndustryLimitedCompany,Bijie,Guizhou551660,China)

To further exploit and utilizeP.impudicus, colorimetric method and pre-column derivatization RP-HPLC method were employed to determine polysaccharide and amino acid respectively, and protein nutritional value was evaluated by using the amino acid ratio coefficient method. Results: Content of polysaccharide inP.impudicuswas 10.82%. The 17 kinds of amino acids determined contained eight kinds of essential amino acids. Meanwhile, the total content of amino acids was 8.72%, and the total content of essential amino acid was 3.59%. The ratio of essential amino acids to total amino acid (E/T) was 40.4%, and the ratio of essential amino acids to non-essential amino acid (E/N) was 0.68. The first restrictive amino acids in this fungus fruiting body were methionine and cystine, and the score of ratio coefficient of amino acid (SRC) was 70.61. Therefore,P.impudicushas extremely high nutritional value and market development value.

Phallusimpudicus； polysaccharides； amino acid

2015-08-21； 2016-03-20修回

贵州省教育厅自然科学研究项目“中药、民族药质量控制及新药研究专业学位贵州省研究生工作站”[黔教研合JYSZ字(2014)016]；贵阳市科技计划项目“医院制剂莲龙胶囊、花红胶囊、康胃胶囊、参黛胶囊和萸藿胶囊的研制和申报”[筑科合同(20151001)药01号]；贵州省普通高等学校特色重点实验室建设项目“贵州分子生药特色重点实验室”[黔教合KY字(2013)108]

张 恩(1991-)，男，在读硕士，研究方向：中药资源分类与质量控制。E-mail：gzyzhangen520@sina.com

*通讯作者：江维克(1962-)，男，教授，从事中药资源调查与质量评价研究。E-mail：jwk_88@163.com

1001-3601(2016)05-0223-0140-04

S38； R284.1

A