不同方法对红托竹荪多糖的脱蛋白效果

叶 敏， 文 竹， 王 庆， 薛天乐， 梁光伟

(1.毕节学院 化学工程学院， 贵州 毕节 551700； 2.亳州职业技术学院， 安徽 亳州 236800)

不同方法对红托竹荪多糖的脱蛋白效果

叶 敏1， 文 竹1， 王 庆2， 薛天乐2， 梁光伟1

(1.毕节学院 化学工程学院， 贵州 毕节 551700； 2.亳州职业技术学院， 安徽 亳州 236800)

为保证多糖的药理活性，以蛋白脱出率和多糖损失率为考察指标，比较Sevag法、TCA法、木瓜蛋白酶法和酶-Sevag联用法对红托竹荪粗多糖脱蛋白的效果。结果表明：木瓜蛋白酶法脱蛋白效果最佳，其最佳脱蛋白条件为木瓜蛋白酶浓度4%、酶解温度55℃、酶解时间3 h，酶液pH 6.0，在此条件下，蛋白脱出率为77.97%，多糖损失率为19.31%。该法用于脱除红托竹荪多糖蛋白质的工艺简单，成本低，具有一定的应用价值。

红托竹荪； 多糖； 脱蛋白方法

红托竹荪(Dictyophorarubrovalvata)是一种担子菌，隶属真菌门(Eumycota)、担子菌亚门(Basidiomycotina)、腹菌纲(Gasteromycetes)、鬼笔目(Phallales)、鬼笔科(Phallaceae)、竹荪属(Dictyophora)，是名贵的大型食用菌之一，野生红托竹荪主要分布在我国贵州中(西)部、云南、四川和浙江等省，多生长于竹林下的腐殖土上[1]。红托竹荪是竹荪家族的珍品，含有丰富的氨基酸、维生素、无机盐和多糖，其中多糖是红托竹荪子实体中重要组成成分之一，连宾等[2]研究发现，红托竹荪多糖的单糖组成为半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖。食用菌生物多糖是一种非特异性免疫增强剂和免疫激活剂，广泛用于医药和保健食品，被称为生物应答调节剂[3]。红托竹荪多糖的分离纯化及其药理活性的前期研究发现，红托竹荪多糖具有体外抗氧化活性[4]。植物多糖中常常混有较多的蛋白质，蛋白质的存在不仅会影响多糖的生理活性和多糖的结构，还会导致多糖的药理活性发生变化[5]。为保证多糖的药理活性，笔者研究比较几种红托竹荪的多糖脱蛋白工艺，以期为红托竹荪资源的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料：红托竹荪子实体购于贵州省毕节市织金县，于50℃干燥至恒重，粉碎，过40目筛，备用。

试剂：葡萄糖标准品(中国药品生物制品鉴定所110833-200901)，考马斯亮蓝G-250(Amresco公司)，牛血清蛋白(Amresco公司)，其余试剂均为国产分析纯，试验用水为蒸馏水。

仪器：GL-20G-C台式高速离心机(长沙迈佳森仪器设备有限公司)，TG16台式高速离心机(长沙迈佳森仪器设备有限公司)，V-5800可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)，SZ-97A自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)，旋转蒸发器RE-2008B(上海亚荣生化仪器厂)，电热干燥箱202-3(金坛市精达仪器制造厂)。

1.2 多糖的提取

多糖的提取参照文献[6]的方法进行。红托竹荪粉末→脱脂(75%乙醇浸泡48 h)→热水浸提→离心取上清液→减压浓缩→醇沉(3倍体积的95%乙醇，置于4℃冰箱静置过夜)→沉淀→洗涤(无水乙醇、丙酮、无水乙醚)→干燥(60℃电热干燥箱)→红托竹荪粗多糖。

1.3 多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法[7]测定多糖含量，以葡萄糖为标准品，在490 nm条件下测定吸光度，得回归方程y=0.020 7x+0.089 7。式中，x为葡萄糖含量(μg/mL)，y为吸光度，R2=0.999 1。

多糖损失率=[(脱蛋白前多糖含量—脱蛋白后多糖含量)/脱蛋白前多糖含量]×100%。

1.4 蛋白质含量的测定

采用考马斯亮蓝法[8]测定蛋白质含量，以牛血清蛋白质为标准品，在595 nm条件下测定吸光度，得回归方程y=0.100 4x+0.711。式中，x为蛋白含量(μg/mL)，y为吸光度，R2=0.999 0。

蛋白脱除率=[(脱蛋白前蛋白含量—脱蛋白后蛋白含量)/脱蛋白前蛋白含量]×100%。

1.5 脱蛋白方法的考察

1.5.1 Sevag法

1) 脱蛋白次数的确定[9]。取50 mL浓度为2 mg/mL的粗多糖溶液，加入1/3倍体积的Sevag试剂(氯仿∶正丁醇=4∶1)，震荡30 min，静置30 min待分层稳定，除去水相与有机相间的蛋白质；取上清液在3 500 r/min离心15 min，然后继续加入Sevag试剂，5次重复，取上清液，测定蛋白质脱出率和多糖损失率。

2) 氯仿与正丁醇体积比的确定[10]。取浓度为2 mg/mL的粗多糖溶液5份，各50 mL，分别加入1/3倍体积的Sevag试剂，Sevag试剂中氯仿与正丁醇的体积比分别为1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，震荡30 min，静置30 min待分层稳定，除去水相与有机相间的蛋白质；3 500 r/min离心15 min，取上清液，测定蛋白质脱出率和多糖损失率。

3) 粗多糖溶液与Sevag试剂体积比的确定[11]。取浓度为2 mg/mL的粗多糖溶液5份，各50 mL，多糖溶液与Sevag试剂(氯仿∶正丁醇=4∶1)的体积比分别为1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，震荡30 min，静置30 min待分层稳定，除去水相与有机相间的蛋白质；3 500 r/min离心15 min，取上清液，测定蛋白质脱出率和多糖损失率。

1.5.2 木瓜蛋白酶法 参照文献[1-12]的方法进行考察。

1) 酶浓度。取10 mL pH值已调为6.0的2 mg/mL红托竹荪粗多糖溶液5份，分别加入终浓度为1%、2%、3%、4%和5%的木瓜蛋白酶，摇匀后于55℃酶解2.5 h，结束后于沸水浴10 min灭酶，测定蛋白质脱出率和多糖损失率。

2) 酶解温度。取10 mL pH已调为6.0的2 mg/mL红托竹荪粗多糖溶液5份，分别加入4%的木瓜蛋白酶，于45℃、50℃、55℃、60℃和65℃酶解2.5 h，结束后于沸水浴10 min灭酶，测定蛋白质脱出率和多糖损失率。

3) 酶解时间。取10 mL 已调pH 6.0的2 mg/mL红托竹荪粗多糖溶液5份，分别加入4%的木瓜蛋白酶，于55℃下分别酶解1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h，结束后于沸水浴10 min灭酶，测定蛋白质脱出率和多糖损失率。

4) 酶液pH。取浓度为2 mg/mL红托竹荪粗多糖溶液5份，各10 mL，当木瓜蛋白酶用量为4%，酶解温度为55℃时，分别在pH为5.5，6.0，6.5，7.0，7.5条件下保温酶解2.5 h，结束后于沸水浴10 min灭酶，测定蛋白质脱出率和多糖损失率。

5) 正交试验。在单因素试验的基础上，以蛋白脱除率和多糖保留率的综合评分为指标，选取酶用量、酶解温度、酶解时间和酶液pH作为考察因素进行L9(34)正交试验，因素和水平见表1，以优化木瓜蛋白酶脱蛋白的试验条件。

表1 酶法脱蛋白的正交试验因素及水平

1.5.3 三氯乙酸(TCA)法 参照文献[5]的方法进行。取浓度为2 mg/mL的粗多糖溶液5份，各10 mL，分别加入5%、6%、7%、8%和9%等体积的三氯乙酸水溶液，震荡30 min，静置1 h，3 500 r/min条件下离心15 min，取上清液，测定蛋白质脱出率和多糖损失率。

1.5.4 酶-Sevag法脱蛋白 参照文献[13]的方法进行。取浓度为2 mg/mL的粗多糖溶液50 mL，加入4%的木瓜蛋白酶，调节pH 6.0，55℃水浴中酶解2.5 h，沸水浴10 min灭酶，冷却后向粗多糖溶液中加入1/3体积Sevag试剂(氯仿∶正丁醇=4∶1)，震荡30 min，3 500 r/min离心15 min，去除沉淀，然后继续加入Sevag试剂，重复处理5次，取上清液，测定蛋白质脱除率和多糖损失率。

2 结果与分析

2.1 Sevag法

从图1可知，Sevag法脱蛋白3次后，蛋白脱出率没有明显升高，而多糖损失率却迅速上升，经过5次脱蛋白后，蛋白脱出率达57.64%，多糖损失率达50.33%。因此，Sevag法脱蛋白3次为最佳，此时蛋白脱出率为62.04%，多糖损失率为31.34%。当氯仿与正丁醇比例为4∶1时，蛋白脱出率最高达66.61%，多糖损失率为10.45%。因此，氯仿与正丁醇的最适比例为4∶1。粗多糖溶液与Sevag试剂按3∶1和4∶1混合后，蛋白脱出率分别为69.24%和68.19%，二者间没有明显差异，多糖损失率分别为12.35%和14.25%，3∶1时的多糖损失率低于4∶1，因此粗多糖溶液与Sevag试剂的最适体积比为3∶1。

图1 不同影响因素红托竹荪多糖的蛋白脱出率和多糖损失率

Fig.1 Protein removal rate and polysaccharide loss rate ofD.rubrovalvatapolysaocharide with different influencing factors

试验结果表明，氯仿与正丁醇体积比对蛋白质脱出率和多糖损失率有影响，粗多糖溶液的体积过多或过少，都会影响蛋白质的脱出率，Sevag试剂处理次数越多，多糖损失率越高。综上所述，对Sevag法脱蛋白条件进行验证，即粗多糖溶液中加入1/3倍体积的Sevag试剂(氯仿∶正丁醇=4∶1)，脱蛋白3次，测得蛋白质脱出率为64.03%，多糖损失率为30.07%。

2.2 酶法

2.2.1 不同因素对酶法脱蛋白效果的影响 由图2可知，随着木瓜蛋白酶浓度的升高，蛋白脱除率逐渐增加，在酶浓度达4%时趋于平稳，此时蛋白脱出率为76.98%，多糖损失率为28.49%；随酶解温度的升高，蛋白脱除率呈先上升后降低趋势，在55℃时，酶活性最强，蛋白脱出率为70.12%，多糖损失率为25.64%；随着酶解时间的增加，蛋白质的脱除率明显增加，在酶解时间达2.5 h后蛋白脱除率变化不明显，多糖损失率随时间延长而升高；随着pH的增加蛋白质脱出率呈先上升后下降的趋势，在pH 6.5时达最高，为71.53%，多糖损失率随着pH的增高而降低，降低幅度不大。

图2 不同酶浓度、酶解温度、酶解时间和酶液pH红托竹荪多糖的蛋白脱出率和多糖损失率

Fig.2 Protein removal rate and polysaccharide loss rate ofD.rubrovalvatapolysaocharide with different enzyme concentration, enzymolysis temperature，enzymolysis time and enzymolysis solution pH

2.2.2 酶法脱蛋白正交试验结果 采用综合加权评分法[11]，权重系数均为0.5，分别把蛋白脱出率和多糖保留率中最大的指标定为100分，其他各项综合评分=(每次脱蛋白率/每组最高脱蛋白率)×0.5×100+(每次多糖保留率/每组最高多糖保留率)×0.5×100，计算结果见表2。对表2中正交试验结果的综合评分进行极差分析(表3)可知，4个因素对综合评分的影响程度不同，由高到低依次为A(酶浓度)>C(酶解时间)>D(酶液pH)>B(酶解温度)，以D(酶液pH)作为误差项进行方差分析可知，A(酶浓度)的F值为28.103>F临界值(19.00)，对综合评分有显著性影响，其他因素均无显著性影响。随着酶浓度的增加，酶与底物接触的机会也增加，蛋白质脱除效果增大，温度升高可以加速酶促反应速度，同时也会加速酶蛋白变性而失去活性，酶的活性在一定pH条件下表现最大的活力，适当延长酶解时间可增加酶促反应速度。因此，酶法脱蛋白的最佳条件为A2B2C3D1，即酶浓度4%、酶解温度55℃、酶解时间3 h，酶液pH 6.0。

表2 红托竹荪多糖酶法脱蛋白正交试验的综合评分

Table 2 Comprehensive score ofD.rubrovalvatapolysaocharide of orthogonal experiment by enzymic method to remove protein

试验号No．酶浓度(A)/%Enzymeconcentration酶解温度(B)/℃Enzymolysistemperature酶解时间(C)/hEnzymolysistime酶液pH(D)EnzymolysissolutionpH蛋白质脱出率/%Proteinremovalrate多糖保留率/%Polysaccharideretentionrate综合评分/%Comprehensivescore1350．02．06．067．8478．1690．902355．02．56．567．4874．3688．383360．03．07．063．6279．1188．754450．02．57．069．2481．9694．675455．03．06．077．5082．9199．436460．02．06．576．6275．3194．857550．03．06．573．2870．5689．838555．02．07．066．6174．3687．819560．02．56．068．1972．4687．69

表3 红托竹荪多糖酶法脱蛋白正交试验各因素水平综合得分的均值与极差

Table 3 The average and range of the comprehensive score ofD.rubrovalvatapolysaocharide of various factors and levels on orthogonal experiment by enzymic method to remove protein

均值Meanvalue酶浓度(A)/%Enzymeconcentration酶解温度(B)/℃Enzymolysistemperature酶解时间(C)/hEnzymolysistime酶液pH(D)EnzymolysissolutionpHk189．34391．80091．18792．673k296．31791．87390．24791．020k388．44390．43092．67090．410R7．8741．4432．4232．263

2.2.3 验证试验 根据正交试验的最佳条件，取粗多糖溶液10 mL，共3份，按最佳条件重复3次试验，计算平均蛋白脱出率为77.97%，平均多糖损失率为19.31%。

2.3 三氯乙酸(TCA)法

由图3可知，随着TCA浓度的增加，粗多糖溶液中蛋白脱出率逐渐增加，但多糖损失率也逐渐上升。TCA是酸性物质，能使蛋白质带正电荷从而与酸根负离子结合成不溶性的盐类，并伴随蛋白质分子变性，但TCA同样会对多糖产生破坏[13]。当TCA浓度为6%时，蛋白脱出率为66.96%，多糖损失率为18.99%；当TCA浓度大于6%时，蛋白脱出率缓慢增加，而多糖损失率快速上升，达41.79%。因此，TCA浓度为6%时，脱蛋白效果最好。

图3 不同浓度TCA红托竹荪多糖的蛋白脱出率和 多糖损失率

Fig.3 Protein removal rate and polysaccharide loss rate ofD.rubrovalvatapolysaocharide with various concentrations of TCA

图4 红托竹荪多糖酶-Sevag法的蛋白脱出率和多糖损失率

Fig.4 Protein removal rate and polysaccharide loss rate ofD.rubrovalvatapolysaocharide detected by enzyme-Sevag method

2.4 酶-Sevag法

由图4可以看出，酶解后的粗多糖溶液，随着Sevag法脱蛋白次数的增加，蛋白脱出率逐渐增加，当脱蛋白3次后，蛋白脱出率上升幅度不大，此时蛋白脱出率为63.62%；多糖的损失率也随着Sevag法脱蛋白次数的增加而上升，经过5次处理后，多糖损失率达到40.84%。

3 结论

植物多糖的纯度常受到自身所含植物蛋白的影响，其药理研究结果往往出现较大差异，因此多糖脱蛋白是多糖纯化的关键[14]。试验比较了Sevag法、TCA法、木瓜蛋白酶法和酶-Sevag法4种方法对红托竹荪多糖脱蛋白效果的影响。4种方法均不能使蛋白质完全脱除，还有残留，可能是因为有部分蛋白质与多糖紧密结合形成糖蛋白而不容易除去。Sevag法在脱出游离蛋白质的同时可能会除去与蛋白质结合的多糖，因此，用Sevag试剂处理的次数越多，多糖的损失率也就越高，Sevag法需要消耗大量有毒有机溶剂，有机溶剂容易造成多糖活性下降和溶剂残留[14]，因此，红托竹荪粗多糖溶液中加入1/3倍体积的Sevag试剂(氯仿∶正丁醇=4∶1)，3次重复的脱蛋白效果最好；TCA溶液的浓度对脱蛋白的效果有较大影响，当TCA浓度为6%时，脱蛋白效果最好，多糖损失率最低；酶-Sevag法联用没有提高蛋白脱出率，可能是因为有机层的包裹使多糖损失率增加[15]；酶法是多糖除蛋白方法中较温和且高效的一种，不引入有机试剂，可以避免总多糖大量降解[15]。因此，酶法对红托竹荪多糖脱蛋白效果最好。然而，不论是采用单一的方法还是采用酶-Sevag法，多糖溶液中仍会有部分蛋白质与多糖牢固结合形成的糖蛋白存在，如需获得更纯的多糖制品，还需要经过其他一系列的精制分离纯化工艺[16]，对多糖中蛋白质的除去方法的选择对多糖的降解程度和多糖药理活性以及结构等的影响，还有待进一步的研究。

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(责任编辑： 孙小岚)

Effects of Deproteinization forDictyophorarubrovalvataPolysaccharide by Different Methods

YE Min1， WEN Zhu1， WANG Qing2， XUE Tianle2， LIANG Guangwei1

(1.CollegeofChemicalEngineering，BijieUniversity，Bijie,Guizhou551700； 2.BozhouVocationalandTechnicalCollege，Bozhou,Anhui236800，China)

To guard the pharmacological activity of polysaccharide, four deproteinization methods including Sevag, trichloroacetic acid ( TCA)， papain method and combination of enzymatic and Sevag method were evaluated in terms of the removal rate of protein and the loss rate of polysaccharide.The results showed that papain method was the best， and the optimal conditions were as following: enzyme concentration 4%，enzymolysis temperature 55℃，enzymolysis time 3.0 h，pH 6.0. Under the above conditions，the removal rate of protein could reach 77.97%, the loss rate of polysaccharide was 19.31%. This process was simple, low cost and applicable for deproteinzation fromD.rubrovalvatapolysaccharide.

Dictyophorarubrovalvata; polysaccharide; deproteinization method

2015-08-17； 2016-03-04修回

贵州省科技厅、毕节市科技局、毕节学院科技联合基金项目“红托竹荪多糖的分离纯化及其药理活性研究”[黔科合J字LKB(2012)06]

叶 敏(1979-)，女，副教授，从事天然产物生物活性研究。E-mail: 28719861@qq.com

1001-3601(2016)05-0221-0131-04

S39; TS201

A