胃癌组织中VEGF-D及MLVD表达及其与预后的关系

邓明佳　沈丽达　张丽娟

作者单位:650118 昆明医科大学第三附属医院，云南省肿瘤医院

胃癌组织中VEGF-D及MLVD表达及其与预后的关系

邓明佳沈丽达张丽娟

作者单位:650118 昆明医科大学第三附属医院，云南省肿瘤医院

【摘要】目的探讨胃癌患者肿瘤组织中血管内皮生长因子-D(vascular endothelial growth factor-D，VEGF-D)及微淋巴管密度(micro-lymphatic vessel density，MLVD)与其生存期的关系。方法收集52例胃癌术后患者标本，采用免疫组化方法检测胃癌组织中VEGF-D、MLVD及胃癌癌旁MLVD。结合临床病理资料，分析VEGF-D、MLVD与其生存期的关系。结果胃癌组织VEGF-D阳性组生存期较阴性组短(P=0.048)，两者间差异有统计学意义；癌旁组织MLVD高组(≥10)较低组(<10)生存期短(P=0.001)，两者间差异有统计学意义；胃癌组织MLVD高组(≥10)较低组(<10)生存期短(P=0.067)，但差异无明显统计学意义。结论胃癌组织中VEGF-D及胃癌癌旁MLVD可作为判断胃癌预后的指标。

【关键词】胃肿瘤；血管内皮生长因-D；微淋巴管密度；免疫组织化学；预后；生存期

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:039～042)

胃癌是起源于胃粘膜上皮的恶性肿瘤，我国每年因胃癌死亡的患者居消化道肿瘤死因首位[1]。初诊时75%的胃癌患者已发展为播散性疾病。胃癌患者的5年生存率约20%～30%[2]。胃癌预后的重要指标有淋巴结转移情况及肿瘤侵犯深度等，且淋巴结转移与淋巴管生成关系密切。近年来，最有代表性的淋巴管生成因子是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)-C和VEGF-D。VEGF-D可刺激淋巴管内皮细胞增殖，诱导淋巴管生成[3]。于1998年研究者通过计算机同源性搜索在核酸数据库中确定了VEGF家族的这个新成员[4]。成人血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)-3是淋巴管生成的特异性调节因子，主要表达于淋巴管内皮细胞。VEGF-D与VEGFR-3结合后，通过MEK/ERK和PI3激酶/Akt途径引起淋巴管内皮细胞增生[5]。在生长初期，肿瘤通过简单扩散的方式获得营养，淋巴管在其中扮演了重要角色。由此可见，淋巴系统转移是判断胃癌预后的重要指标。目前，它在肿瘤淋巴系统转移中的研究越来越多。本研究主要检测胃癌的VEGF-D及MLVD，结合临床资料分析胃癌VEGF-D和MLVD与生存期的关系，探讨其临床意义。

1材料与方法

1.1　一般资料

52例患者均来自云南省肿瘤医院，均为2004年1月-2007年6月行手术的胃癌患者。其中男性30 例，女性22 例。年龄25～81岁，中位年龄62岁，≥60岁者20例，<60岁者32例。高、中分化胃癌18例；低分化胃癌34例。淋巴结转移者36例，淋巴结无转移者16例。Ⅰ、Ⅱ期18例，Ⅲ、Ⅳ期34例；52例患者术前均未行放、化疗。

1.2　材料

所用抗体均购自福建迈新生物技术开发有限公司：鼠抗人D2-40单克隆抗体(浓缩型，产品编号为MAB-0567)、兔抗人VEGF-D多克隆抗体(浓缩型，产品编号为RAB-0601)。抗原修复缓冲液：柠檬酸盐缓冲液(0.01 mmol/L，pH 6.0)、EDTA缓冲液(1 mmol/L，pH=8.0)按1:75的比例稀释。其他试剂：二甲苯、10%福尔马林液、3%双氧水甲醇液、PBS(pH 7.2～7.4)液、增敏二氨基联苯胺(DAB)显色液、蒸馏水等。

1.3　方法

1.3.1组织标本的处理和免疫组化染色选取外科手术切除且常规组织学确诊为胃癌组织以及同一患者癌旁组织(肿瘤浸润边缘以外，距肿瘤<2 cm)，同时收集肿瘤切缘阴性、离病灶5 cm以上的正常胃组织52例为对照组。经10%中性福尔马林缓冲液固定新鲜标本，常规脱水、浸蜡及石蜡包埋。HE染色片用于组织病理学诊断。形态典型的切片用于免疫组化染色。

1.3.2免疫组化结果判定阳性染色反应的分级判断标准。VEGF-D阳性物质呈现棕黄色细颗粒状，主要于细胞质着色，个别病例癌细胞胞核及胞质着色，偶见着色于脉管内皮细胞及间质细胞。参照邢传平等[6]免疫组化染色结果判定相关文献进行。本研究将弱阳性(+)、中度阳性(++)、强阳性(+++)合并为阳性(+)作统计分析。D2-40免疫组化染色计数MLVD。淋巴管判定标准：D2-40阳性染色定位于淋巴管内皮细胞胞膜和胞质，呈棕黄色颗粒状。

1.3.3随访根据云南省肿瘤医院病理科提供的患者住院号及姓名查找该患者的住院病历，获取有助于随访的其它资料包括家庭住址和电话，并且确定患者术前未行放疗和化疗。通过电话进行随访，随访得到52例患者生存资料，随访时间为1～72个月。

1.4　统计学分析

2结果

2.1　胃癌组织VEGF-D阳性组和阴性组生存期比较

VEGF-D在胃癌组织和正常组织中呈不同程度表达，阳性物质呈棕黄色细颗粒状，多数定位于细胞质。结果显示胃癌组织VEGF-D阳性组生存期较阴性组短(卡方值3.927，P=0.048)，两者间差异有统计学意义，见表1，图1。

表1　胃癌组织VEGF-D阳性组和阴性组生存情况

图1　胃癌组织VEGF-D表达阳性与阴性患者生存期比较

2.2　癌旁组织MLVD高低患者生存期比较

癌旁组织MLVD高者较低者生存期短(卡方值10.145，P=0.001)，两者间差异有统计学意义，见表2，图2。

表2　癌旁组织MLVD高低患者生存期情况

图2　癌旁组织MLVD高低患者生存期比较

2.3　胃癌组织MLVD高低患者生存期比较

胃癌组织MLVD高者较低者生存期短(卡方值3.352，P=0.067)，但两者间差异无明显统计学意义，见表3，图3。

3　讨论

淋巴系统转移是胃癌最常见的播散方式。特异性淋巴管标记物发现后，人们对肿瘤淋巴管生成的研究可以更进一步。D2-40作为淋巴管内皮细胞较为特异的标记蛋白之一。用它标记MLVD能反映肿瘤淋巴管侵犯及淋巴结转移。但MLVD与胃癌生存期关系的研究很少，且未有定论[8-9]。血管内皮生长因子-D (vascular endothelial growth factor-D，VEGF-D)被认为与肿瘤淋巴管生成密切相关，它与胃癌患者预后的关系需要进一步研究。

表3　胃癌组织MLVD高低患者生存期情况

图3　胃癌组织MLVD高低患者生存期比较

3.1　胃癌组织VEGF-D的表达与生存的关系

本组研究显示，胃癌组织VEGF-D阳性组生存期较阴性组短(P=0.048)，两者间差异有统计学意义。我们既往曾研究胃癌组织VEGF-D表达与临床因素的关系，结果显示胃癌组织无淋巴结转移组VEGF-D的阳性率低于淋巴结转移组(P<0.01)。Ⅰ、Ⅱ期患者胃癌组织VEGF-D阳性率低于于Ⅲ、Ⅳ期(P<0.05)。癌旁组织无淋巴结转移组VEGF-D的阳性率亦低于淋巴结转移组(P<0.01)，Ⅰ、Ⅱ期患者癌旁组织VEGF-D阳性率低于Ⅲ、Ⅳ期(P<0.05)。可认为VEGF-D促进了淋巴管增生，而淋巴管增生活跃导致淋巴结转移几率增加，淋巴结转移率越高则肿瘤分期越晚，生存期也越短。Wang 等[8]研究认为胃癌组织中VEGF-D、VEGF-C、VEGF-A的高表达致总生存期缩短。Deng 等[10]的研究认为，VEGF-D是胃癌根治术后肝转移的独立预后因素，并且发现此类患者VEGF-D阳性者DFS较阴性者缩短。Liu等[11]研究显示循环血中VEGF的表达较组织中的VEGF更能指导胃癌患者预后。国外亦有相关报道，Shida等[12]研究认为，VEGF-D是胃癌患者RFS和OS的独立预测指标。Jüttner等[13]认为，VEGF-D、VEGFR-3是胃腺癌切除术后患者不良预后的指标。但也有相反观点，Schimanski等[14]研究显示，胃腺癌患者组织VEGF-D的表达与胃癌转移有关，但并未显示其对生存期的影响。但也有较多试验显示，胃癌组织VEGF-D并非患者预后的可靠指标[8,15-17]。以上多项实验表明，VEGF-D的表达与肿瘤淋巴结转移及临床分期有关。淋巴结转移、分期晚者VEGF-D阳性率越高，生存期越短。VEGF-D有望成为肿瘤淋巴管侵犯和淋巴结转移的预测指标。

3.2　胃癌癌旁组织MLVD与生存期的关系

本研究显示，癌旁组织MLVD高组较低组生存期短(P=0.001)，两组间差异有统计学意义。我们既往研究胃癌组织、癌旁及正常组织MLVD的比较显示，52例胃癌在以上3组MLVD表达情况为癌旁组织最高、胃癌组织最低，两两比较差异均有统计学意义(P<0.01)。癌旁组织的MLVD更能反映患者的预后。Rudno-Rudzinska等[9]认为VEGF-D能指导进展期胃癌的OS，胃癌组织LVD(lymphatic vessel density)及胃癌癌旁组织LVD对进展期胃癌患者生存期有影响。

3.3　胃癌组织MLVD与生存期的关系

胃癌组织MLVD高组较低组生存期短(P=0.067)，两者间差异无明显统计学意义。我们既往研究胃癌VEGF-D表达和不同区域MLVD的关系显示，VEGF-D阳性的癌旁组织中MLVD高于VEGF-D阴性者，差异有统计学意义(P<0.05)，而胃癌组织中两者MLVD比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究显示，胃癌组织VEGF-D阳性者生存期较阴性者明显缩短。我们既往研究显示，胃癌癌旁组织VEGF-D阳性者MLVD显著高于阴性者，可以认为癌旁组织MLVD的升高可能受到VEGF-D刺激所致。而胃癌组织中VEGF-D阳性者MLVD与阴性者差异不明显。这种现象考虑与胃癌中心组织受压明显，脉管生长不正常有关。

3.4　VEGF-D及MLVD与胃癌预后的关系

目前进展期胃癌的治疗仍很困难。新化疗药物联合分子靶向药物的治疗已进入临床，并成为非手术治疗的主要手段。抗淋巴管生成的药物实验仍处于实验阶段[18-19]。经多年研究，人们证实了淋巴管生长因子促进肿瘤淋巴结转移和淋巴管生长的作用，明确了淋巴管生成的部分分子机制。VEGF-D/VEGF-C/VEGFR-3信号通路的发现奠定了肿瘤转移的研究基础。然而，肿瘤中新生淋巴管与原有淋巴管之间的关系，它们在肿瘤转移中所起的作用，肿瘤转移的具体过程和详细机制，以及怎样参与肿瘤淋巴管形成、肿瘤转移的信号通路和其他生长因子还有待进一步研究。靶向治疗药物提高了部分化疗耐药肿瘤的疗效。它们与化疗、放疗以及其他分子靶向药物的联合治疗的疗效，有望进一步提高。今后将收集更多病例进行生存与预后分析，还可以结合胃癌的其他肿瘤相关预后指标进行研究，得出更为完整的结果。

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(编辑：吴小红)

·临床研究·

(编辑：吴小红)

Relationship between Expression of VEGF-D and MLVD in Gastric

Cancer Tissues and Prognosis

DENGMingjia,SHENLida,ZHANGLijuan.TheThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,YunnanTumorHospital,Kunming,650118

【Abstract】ObjectiveTo study the relationships between expression of vascular endothelial growth factor-D( VEGF-D) and micro-lymphatic vessel density(MLVD) of gastric cancer tissues and overall survival.Methods52 samples of resected gastric cancer were gathered.The expression of VEGF-D in gastric cancer,intratumoral MLVD and peritumoral MLVD were stained immunohistochemically.Clinical data and stastistical analysis were combined to find the relationship in VEGF-D,MLVD and overall survival.ResultsThe overall survival of VEGF-D positive group was significantly shorter than that of negative group (P=0.048).There was statistical difference between the 2 groups.The overall survival of peritumoral high MLVD group(≥10) was significantly shorter than that of low MLVD group(<10)(P=0.001).There was statistically difference between the 2 groups.But the overall survival of intratumoral high MLVD group(≥10) was not statistically shorter than low MLVD group(<10)(P=0.067).ConclusionThe detection of VEGF-D and peritumoral MLVD in the tissue of gastric cancer can be regarded as unfavorable prognostic indicator for patients with gastric cancer.

【Key words】Stomach neoplasms;Vascular endothelial growth factor-D( VEGF-D);Micro-lymphatic vessel density(MLVD);Immunohistochemistry;Prognosis;Survival time

中图分类号：R735.2

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)01-0039-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.01.012

通讯作者：沈丽达

收稿日期(2015-01-20修回日期 2015-04-29) (2015-02-04修回日期 2015-05-18)