基于微卫星标记建立翘嘴鳜亲子鉴定技术

成为为，杨　凯，高银爱，朱思华，李　波，王青云，罗　峰，夏儒龙，程颖红，

邓国乔，郑翠华

(武汉市水产科学研究所，武汉市农业科学技术研究院，武汉　430207)



基于微卫星标记建立翘嘴鳜亲子鉴定技术

成为为，杨凯，高银爱，朱思华，李波，王青云，罗峰，夏儒龙，程颖红，

邓国乔，郑翠华

(武汉市水产科学研究所，武汉市农业科学技术研究院，武汉430207)

摘要：利用9个多态性较高的微卫星标记对翘嘴鳜(Sinipercachuatsi)进行亲子鉴定分析。结果显示，22个家系翘嘴鳜个体中共观测到95个等位基因，其观测杂合度和期望杂合度的平均值(范围)分别为0.578(0.219~0.800)和0.607(0.200~0.806)，多态信息含量(范围)为0.552(0.187~0.787)。通过软件Cervus统计分析得到9个微卫星座位累计排除率为99.9658%，在27个可能的父母对条件下，混养养殖家系后代个体鉴定准确率为91%，研究结果表明筛选的这些多态微卫星分子标记可以用于翘嘴鳜优势家系的鉴定和分离，通过验证的微卫星标记建立的亲子鉴定技术为基础选育翘嘴鳜生长速度快的优势家系，为培育出生长速度快、抗病力强的翘嘴鳜新品种奠定基础。

关键词：翘嘴鳜(Sinipercachuatsi)；微卫星标记；亲子鉴定；家系选育

翘嘴鳜(Sinipercachuatsi)为我国淡水名优鱼类。自鳜人工繁殖成功以来，翘嘴鳜人工养殖规模迅速扩大，但繁养单位不注重鳜亲鱼选育和保种工作，在繁殖过程中近亲繁殖严重，导致养殖群体种质资源退化、抗病力下降等。培育抗病能力强、生长速度快的优势品种是鳜养殖产业健康和可持续发展亟待解决的重要课题之一。在实际的养殖实施过程中，若通过分池饲养可保证准确的家系信息，却存在占用空间大、管理强度大等问题，最重要的是不同的养殖环境对性状的影响会导致遗传性状参数的估计误差。

目前，亲子鉴定技术在水产动物中已得到广泛的应用，关于亲子鉴定准确率的研究已经有很多报道，在水产动物如鳀(Engraulisencrasicolus)[1]、鲍鱼(Haliotisdiscushanna)[2]、绿蚌贝(Pernacanaliculus)[3]、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)[4]、日本对虾(Penaeusjaponicus)[5]等水产动物亲子关系鉴定中也有相应的应用。水产动物早期亲子鉴定的遗传标记主要有同功酶电泳、随机扩增多态性DNA标记(RAPD)和限制性片段长度多态性(RFLP)，但存在多态信息含量相对较低，以及重复性、稳定性和可比性相对较差的问题。高度变异的微卫星DNA(Microsatellite DNA)具有检出率高、信息量大、高度保守、共显性遗传、遗传稳定、遵循孟德尔遗传规律且检测方便快速等特点就成为最有效的分子遗传标记[6]，在种质资源调查、遗传多样性评估和系谱鉴定中显示了强大的确证作用[7]，可用于确定其父母本、分析家系谱系和确证种属关系[8-9]。Dena等[10]的研究更证实微卫星标记在没有外部物理标记的人工混合养殖情况下也可以区分出混养群体所属的正确家系。本研究以武汉市水产科学研究所通过家系选育的翘嘴鳜个体为实验材料，选取微卫星标记在翘嘴鳜家系谱系鉴定中进行应用，利用9对高度多态的翘嘴鳜微卫星标记，通过计算机软件模拟分析，摸索微卫星亲子鉴定的条件，以及亲子鉴定在翘嘴鳜谱系鉴定中的应用条件及价值，为翘嘴鳜新品种的选育提供分子生物学理论依据。

1材料和方法

1.1实验材料

2010年5月，课题组分别从广东省佛山市南海区石啃鱼苗场和武汉市佳恒水产有限公司引进种苗5 000尾，选留500尾具备生长优势的个体作为广东养殖群体建系亲本和湖北养殖群体建系亲本；2012年3月从湖北省嘉鱼县长江白沙洲段捕捞50尾1 kg以上的2龄个体作为野生群体的建系亲本。2014年4月，18尾翘嘴鳜繁殖亲鱼(来自湖北群体、广东群体和野生群体雌性和雄性各3尾)通过人工繁殖获得27个翘嘴鳜全同胞家系，刚开始各个家系分开养殖，待苗长到2 cm时，在每个家系取2尾确定亲缘关系用于验证微卫星标记亲子鉴定技术的可靠性。随后将所有家系后代个体在各个家系取1 000尾子代个体样本后进行混池养殖，并且在相同的条件下进行饲养，待子代个体长到12月时，所有子代个体全部起塘，选取具有生长优势的个体274尾(体重大于500 g)剪鳍条用无水乙醇保存，并在背部挂上数字挂牌标志用于区分选育的家系个体。

1.2PCR扩增及电泳检测

DNA提取采用试剂盒法提取基因组DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后稀释到约100 ng/μL用于PCR扩增。实验先选取34个翘嘴鳜微卫星标记用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行多态性筛选，随后选取其中9对多态性高的微卫星标记[11-12]合成荧光引物(FAM和HEX)，在各自特定的退火温度下进行PCR扩增，PCR扩增体系和反应程序如下，PCR反应体系为25 μL：TaqDNA聚合酶0.5 μL(1 U/μL)，10×TaqBuffer 2.5 μL，MgCl22.5 μL，dNTP 0.5 μL，上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，DNA 100 ng。扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，退火40 s(各引物最适退火温度见表1)，72 ℃延伸45 s，38个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物经自动测序仪ABI 3730 xl(Rox-500 standard)测序并用软件GENEMAPPER V.4.0[13]读取等位基因大小。

1.3家系鉴定分析

利用软件Cervus 2.0[14]分析各个基因座上的等位基因频率、观测杂合度Ho和期望杂合度He、多态信息含量PIC、非亲权排除率(NEP)和累计非亲权排除率(CEP)，检测微卫星位点是否符合Hardy-Weinberg平衡及各位点无效等位基因频率，再以父母本双盲建模(simulation)模拟运行10 000次得到Delta分布值，以每个候选父母的LOD(the nature log of the overall Likelihood atio)值进行亲子鉴定分析[15]。

2结果与分析

2.1微卫星座位模拟分析

实验所用9对微卫星引物均能扩增出目的条带，9个微卫星标记分析检测得到95个等位基因。其中等位基因数最少的为座位MDJ879和DQ789303，最多的为座位D290和D295，均检测到17个等位基因(如表1)，其中的6对标记聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图1所示，微卫星测序图如图2所示。其观测杂合度为0.219~0.800(平均值为0.578)，期望杂合度为0.200~0.806(平均值为0.607)，多态性信息含量为0.187~0.787(平均值为0.552)，所有座位均不偏离Hardy-Weinberg指数。微卫星标记主要多态性参数见表1，非亲排除率(NEP)和累积非亲权排除率(CEP)见表2。

表1　本研究所用的9个微卫星引物的主要多态性参数和Hardy-Weinberg检测结果

注：NS表示未显著偏离 Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)；

图1　部分引物筛选聚丙烯酰胺凝胶电泳图

图2　翘嘴鳜微卫星座位基因分型结果

2.2分养家系的鉴定

通过Cervus 2.0软件分养家系44个子代个体与18个亲本亲子鉴定分析结果显示，9个微卫星座位累计非亲权排除率为99.9658%， 共有40尾在95%非亲权置信区间LOD值大于零且没有错配座位(部分数据如表3)。进一步证实了这9个微卫星标记用于翘嘴鳜亲子鉴定的准确性。

表2　非亲权排除率(NEP)和累积非亲权排除率(CEP)

表3　翘嘴鳜亲子鉴定结果

注：F：子代个体；HB：湖北渔场；YT：长江江段；GD：广东渔场

2.3混养家系的鉴定

选用已经验证可以用于翘嘴鳜亲子鉴定的9个微卫星座位对选育出来的278尾优势翘嘴鳜进行亲子鉴定分析，结果显示，其中86尾来自广东2号(雌)与广东5号(雄)繁殖后代，51尾来自广东3号(雌)与广东5号(雄)繁殖后代；而湖北亲本总共产生49尾优势后代个体，3尾雌鱼亲本和3尾雄鱼亲本优势后代没有显著性差异；长江2号(雌)和3号(雌)分别与3尾雄鱼产生优势后代为18尾和15尾。

3讨论

3.1翘嘴鳜的家系鉴定

传统物理标记主要有外部形态的区分[16]、茜素络合物或盐酸四环素溶液浸泡鱼仔、耳石标记、可见荧光标记(VIE)或编码金属标(CWT)[17]，这些方法存在操作繁琐、费用昂贵、对鱼体有伤害且标志容易脱落等缺点。而微卫星分子标记因其数量较多、分布广泛、多态性丰富等诸多优点，近年广泛应用于基因连锁图谱构建[18]、亲缘关系鉴定[19-20]、遗传多样性分析[21]等诸多领域。翘嘴鳜选育过程中为保持正确的系谱关系需借助分子标记进行亲缘关系鉴定。用微卫星DNA测序法进行亲子鉴定技术精确度高，且发展快，但早期由于成本较高在水产动物中较难开展和推广，随着分子生物学的发展和测序成本的降低，亲子鉴定技术在水产动物中得到广泛的应用。基于以上筛选合适的分子标记用于亲子鉴定，代替传统的血型、DNA指纹等方法。

本研究中，通过9个有效的微卫星标记从18个候选亲本中鉴定子代父母本，鉴定的准确率则很大程度上受所选微卫星分子标记的影响，即对数目相同的标记而言多态性越丰富其鉴定准确率越高，本研究中当座位数达到4个时，CEP(累积排除概率)就超过了97.50%；座位数达到6个时，CEP值为99.92%；座位数为9个时，CEP为99.97%(表2)，进一步确定了这9个座位用于翘嘴鳜亲子鉴定的准确性，将亲子鉴定技术运用在翘嘴鳜育种过程中，能够更加准确地构建家系，有效地避免近亲交配，防止种质退化。

3.2优势家系个体的确定

品种是生产养殖的物质基础，培育生长速度快、高产优质和抗病力强的优良品系是当前水产养殖增产和农民增收的有效途径。传统的新品种培育方法主要是选择育种，已经培育的水产动物新品种，如荷包红鲤(Cyprinuscarpiovar.Wuyuanensis)、德国镜鲤(C.carpioL.)、彭泽鲫(Carassiusauratusvar.Pengzesis)选育系等。传统育种方法对推动世界水产养殖业的发展发挥了重要的作用，但育种周期长、预见性差、工作量大、工作效率低等问题严重制约了选择育种的快速发展。

参考文献:

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(责任编辑：张红林)

Microsatellite DNA markers for parentage test of

Siniperca chuatsi

CHENG Wei-wei,YANG Kai,GAO Yin-ai,ZHU Si-hua,LI Bo,WANG Qing-yun,LUO Feng,

XIA Ru-long,CHENG Ying-hong,DENG Guo-qiao,ZHENG Cui-hua

(WuhanFisheriesScienceResearchInstitute,WuhanAcademyofAgriculturalScience&Technology,Wuhan430207)

Abstract：In this study,9 microsatellite markers were used to analyses the paternity test ofS.chuatsi.A total of 95 alleles were obtained and the mean observed and expected heterozygosis was 0.578 and 0.607,respectively.The combined non-exclusion probability (first parent) of 9 loci was 99.9658%.For the 27 putative parents,the testing accuracy was 91%.The results indicated that the microsatellite DNA markers can be used for the parentage determination ofS.chuatsi.

Key words：Sinipercachuatsi;microsatellite loci;parentage test;superior families

中图分类号：S917.4

文献标识码：A

文章编号：1000-6907-(2016)01-0029-04

作者简介：第一成为为(1986-)，女，博士，主要研究方向为遗传育种。E-mail：chengweiwei9922@163.com通讯作者：高银爱。E-mail：304104752@qq.com

收稿日期：2015-04-20；

修订日期：2015-10-10

资助项目：武汉市农科院创新项目