有机磷农药毒死蜱降解菌的筛选及生理生化特性研究

刘虎成+杨丽萍

摘  要：本文采用微生物修复农药污染的方法，从武汉市江夏区长期受有机磷农药污染的土壤中驯化、分离、筛选出几株生长最具优势的降解有机磷农药毒死蜱的菌株，分析和研究了单菌株和复合菌株对土壤的降解效果。实验结果表明，在7种组合和2个空白对照的对比下，AB菌株组合成为最佳组合降解菌，证明在实验环境中确实存在菌种间的相互作用来促进其对农药的降解，且降解效果明显。另外，研究了不同温度、PH值、碳源、氮源等环境因子对优势菌株生长的影响。

关键词：毒死蜱;农药残留;降解;复合菌株

中图分类号：S182 文献标识码：A

1 引言

毒死蜱（Chlorpyrifos），即氯吡硫磷，作为一种中毒性有机磷杀虫剂类农药， 作用效果好，药效持续时间长，在我国乃至世界都有着广泛的使用，目前逐渐替代高毒性有机磷农药。在施用中，会残留于土壤、水、作物叶片上。如果不及时处理，会随着挥发性和移动性富集于生物体内，最后随着生物链进入人体，危害人体健康。目前对于农药污染的研究有很多，对毒死蜱也是如此。通过对他人研究成果的分析，笔者发现“研究过多的集中在一种高效降解菌的提取和研究”，即人们研究的高效降解菌株多局限于一株，然而单一的菌株易受土壤环境和土著微生物的影响，降解效率极易下降，并且土壤中的微生物环境极其复杂，降解农药污染不是一株降解菌就可以降解到人们满意的效果。笔者从长期使用受机磷农药污染的农田取样，以含有毒死蜱农药的培养基筛选耐性菌株。通常情况下，在较高浓度的培养基中会出现多种耐性菌种，在多次循环使用农药培养基培养后，菌种会逐渐稳定，其中极有可能出现含有毒死蜱抗性的降解菌株。然后通过组合培养可以确定复合菌株能否提高分解效率，以期证明环境中确实存在菌种间的相互作用来促进其对农药的降解，研究结果可以为农药污染的土壤生物修复相关研究提供一定的依据。

2 材料与方法

2.1 实验材料

土样：取自江夏区长期受有机磷农药污染的田地中，风干，避光保存。

农药：毒死蜱（美国陶氏益农公司登记注册）

2.2 试剂及设备

（1）试剂 KH2PO4，MgSO4·7H2O，（NH4）2SO4，蔗糖，HCl，NaOH，革兰氏染色试剂，琼脂，牛肉膏，乙酸乙酯。

（2）仪器设备 PGX-250多段光照培养箱（宁波）;UV-1800紫外-可见分光光度计（日本）;奥林巴斯BX51显微镜（日本）;光照恒温摇床（上海）。

（3）富集培养基（液体）配方：K2HPO4·3H2O 13.3g，KH2PO4 4g，MgSO4·7H2O 0.2g，（NH4）2SO4 0.5g，蔗糖10g，水1000mL，PH 7.0。

（4）牛肉膏蛋白胨培养基（液体）配方：牛肉膏 3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，水 1000mL，PH 7.5。

（5）农药储备液：准确移取毒死蜱农药，用乙酸乙酯为溶剂配制成质量浓度为0.5g/L的毒死蜱农药储备液，于冰箱中保存，使用时根据实际需要配置成不同浓度的标准工作液。

2.3 实验方法

2.3.1 菌种的筛选、分离和提纯方法

土壤样品来自江夏区纸坊附近的农田，取2g新鲜土壤加入98g蒸馏水，摇匀制成悬浮液。取悬浮液的25%加入到含有一定量毒死蜱的培养基中，放入摇床中震荡培养，30℃，100r/min转培养48小时。48小时后移取悬浮液500微升于50mL含有一定量的毒死蜱的培养基中，然后在摇床继续培养48小时，条件一致，重复3次。采用平板划线法分离菌种，通过多次分离，在显微镜下观察细菌形态确定得到三株优势菌种，暂命名为A菌，B菌，C菌，分别挑取A、B、C，接种于50mL富集培养基中，30℃，120r/min，振荡培养24h（富集培养），得到三种纯的菌液备用。

2.3.2  不同组合菌株降解毒死蜱的土壤模拟实验方法

实验土壤取回后风干过40目筛备用。采用a、b、c三个处理组，每个处理组重复两次。向每个锥形瓶中加入50 g土壤，25mL水，作如下处理：

a 组：1、灭菌、加入A菌悬液6mL、农药储备液2mL;2、灭菌、加入b菌悬液6mL、农药储备液2mL;3、灭菌、加入c菌悬液6mL、农药储备液2mL;4、灭菌、加入a、b菌悬液各3 mL、农药储备液2mL;5、灭菌、加入a、c菌悬液各3 mL、农药储备液2mL;6、灭菌、加入b、c菌悬液各3 mL、农药储备液2mL;7、灭菌、加入a、b、c菌悬液各2 mL、农药储备液2mL;

b 组：灭菌、未加入菌悬液，加入农药储备液2 mL;

c 组：未灭菌、未加入菌悬液，加入农药储备液2 mL。

其中，b、c两组均为空白对照组，b组为了测定土壤和农药之间的吸附关系，c组为了测定土壤固有微生物和农药之间的降解关系。需要灭菌的样品放入高压灭菌锅中，121℃条件下灭菌30min。将灭菌后的样品和C组样品放入30℃振荡培养箱中培养，其间分别在第1、4、7、11、15、21天取样，用紫外可见分光光度计测定各对应组别对毒死蜱的降解率。每周向A处理组中加入对应等量的菌悬液，并于试验期间每隔3天进行称重和补足流失水分，保证试验期间土壤中总含水量维持在一个较稳定的水平。

2.3.3 降解纯菌株及复合菌株的生理生化特性研究

将分离出的优势降解菌株利用革兰氏染色法，在生物数码显微镜下观察菌体形态大小。在优势菌株的培养过程中，通过对培养基配制不同的PH值、碳源、氮源，设定不同的培养温度，采用不同的接种方式，研究环境因子（氧气，PH值，温度，碳源和氮源）对优势菌株生长的影响。

2.4 毒死蜱提取及其测定方法

2.4.1 毒死蜱标准曲线

配制浓度分别为0.0001mg/mL、0.0002mg/mL、0.001mg/mL、0.002mg/mL、0.005mg/mL的毒死蜱溶液，采用紫外分光光度计于293mm波长下测定各浓度溶液的吸光度，绘出吸光度-浓度标准曲线。

2.4.2 土壤中毒死蜱的残留提取方法

称取1.0g土壤，加入少量乙酸乙酯，充分摇匀混合，混合物用滤纸过滤，过滤前撒上少量无水硫酸钠以吸收土样中的水分，过滤过程中多次加入乙酸乙酯于试管中冲洗，最后定容至5毫升。采用紫外分光光度计于293mm波长下测定吸光度。

3 实验结果与分析

3.1 各处理组菌株降解结果与分析

由图1、图2可知，培养第一天，各个处理组的残留量减少约一半，初始添加量均为0.5mg，共九个处理组在添加农药一天后均下降为0.2mg左右，在此初步认为是土壤颗粒的吸附所致。由于土壤的吸附性，毒死蜱滴入土壤中后迅速被吸附并进入颗粒内部，而乙酸乙酯在常规手段下难以有效溶解吸附在颗粒内部的毒死蜱，导致无法析出，因而在测定时含量下降。在第3天即第2次测量时除a3组含量降低不明显，其他几组含量均有较大幅度下降，下降趋势相似。第8天测量时，b组浓度出现回升，可能是土壤吸附的毒死蜱重新释放回土壤所致，a6组与b组变化趋势相近。除a3组外其他各组均出现持续下降，说明添加菌种均对毒死蜱产生降解效应，但是否确实为降解还无法确定。培养至第21天，毒死蜱残留量出现不同程度下降，其中a4、a5、a1组与b、c组相比下降尤为明显，残留量分别为0.114mg、0.138 mg、0.164 mg。残留量由高到低排序为a3>b>a2>a6>a7>b>a1>a5>a4，即降解量a4>a5>a1>c>a7>a6>a2>b>a3，而降解量前三的组别中均有菌种A，由此可以断定菌种A确实对毒死蜱具有一定的吸收或降解能力，而相比于A菌种单独或与其他菌种的组合，A菌种与B菌种的组合在降解效率上显得尤为突出。这一结果表明，本次实验最终筛选得到的最优组合为AB菌种组合，对于其他组合，除a3无明显效果外，均呈现出比B组（空白组）降解效果好的趋势，而并未呈现出比C组（全菌种模拟野外环境组合）具有更明显优势的趋势，说明筛选出的A、B、C三个菌种中A菌、B菌具有吸收或降解能力，而C菌无明显吸收或降解能力。

3.2 优势菌株生理生化特性研究结果与分析

3.2.1 显微形态

A菌株为革兰氏阴性菌，菌体为长杆状，有鞭毛，有芽孢，菌落圆形，淡黄色，不透明，凸起，边缘整齐;b菌株为革兰氏阴性菌，菌体为短杆状，无鞭毛，无芽孢，菌落圆形，淡黄色，不透明，凸起，边缘整齐;c菌株为革兰氏阳性菌，菌体为短杆状，无鞭毛，无芽孢，菌落圆形，淡黄色，不透明，凸起，边缘整齐。

3.2.2 氧气和温度对分离菌株的影响

A、B菌株在只在试管的表面处生长，因此A、B菌均为专性好氧菌。c菌株在试管的接近表面处和表面处生长，因此C菌为兼性厌氧菌。

由表1可以看出，单菌株的最适宜生长温度在30-37℃，高于45℃或低于4℃菌株不生长;AB复合菌株的最适宜生长温度在15-37℃，高于45℃或低于4℃菌株不生长。此复合菌株对温度的适应能力稍强于单菌株对温度的适应能力，说明复合菌株更能适应自然条件。

3.2.3 PH值、碳源和氮源对菌株的生长的影响

由图3可以看出，当PH在5-9之间时，A、B、C和复合菌株三个菌株生长情况较好，PH在9以后，各菌株的生长情况随着PH的增大而减小;复合菌株在不适宜生长的PH为2、4、10时的OD600均稍高于每一个单菌株，可以看出，复合菌株更加适宜在自然条件下生长。

由图4可知，A菌株和复合菌株在以蔗糖为唯一碳源时，生长量最好，下面依次为葡萄糖、淀粉、毒死蜱。而B菌株和C菌株在以葡萄糖为唯一碳源时，生长量最好，下面依次为毒死蜱、蔗糖、淀粉。但A菌株和复合菌株对上述碳源都可以进行降解，且降解率差异不大，这样更有利于自然环境中的生长。

由图5可知，A菌株和B菌株在以蛋白胨为唯一氮源时，生长量最好，下面依次为牛肉膏、毒死蜱、酵母膏。C菌株在以牛肉膏为唯一氮源时，生长量最好，下面依次为蛋白胨、毒死蜱、酵母膏。这说明，在有其他营养物质作为氮源时，降解菌首先降解其他物质，但是在有毒死蜱存在时，这些菌株的生长量差别不是很大，所以对毒死蜱的降解影响不大。复合菌株在以蛋白胨为唯一氮源时，生长量最好，下面依次为毒死蜱、牛肉膏、酵母膏，可以看出复合菌株对毒死蜱有较好的降解效果。

4 结论和建议

在单菌株处理组中，菌株a对毒死蜱的降解效果最好;复合菌株处理组中，菌株ab对毒死蜱的降解效果最好。在9组菌株处理组中，AB菌种组合成为最佳组合，证明在实验环境中确实存在菌种间的相互作用来促进其对农药的降解，效果明显。生理生化研究表明，a菌种为专性好氧菌，在30℃，PH为8，蔗糖为唯一碳源，蛋白胨为唯一氮源的条件下时，对毒死蜱的降解量最高;ab组合菌种在30℃，PH为8，蔗糖为唯一碳源，蛋白胨为唯一氮源的条件下时，对毒死蜱的降解量最高。

由于实验时间和实验条件所限，实验还需继续深入，例如相关三个菌种之间的相互作用，降解效果定量分析，菌种定量搭配分析，菌种生物学鉴定等还需要进一步研究。

（指导老师 万  红）

（本文审稿 刘向明）