全反式维甲酸联合LY294002对食管癌EC1细胞增殖、迁移及PI3K、MMP-2表达的影响*

崔会娟，李　娜，路彦娟，李珊珊，王珍珍，路太英#

1)郑州大学第一附属医院肿瘤科 郑州 450052　2)焦作市第二人民医院肿瘤科 焦作 454002



全反式维甲酸联合LY294002对食管癌EC1细胞增殖、迁移及PI3K、MMP-2表达的影响*

崔会娟1)，李娜1)，路彦娟1)，李珊珊1)，王珍珍2)，路太英1)#

1)郑州大学第一附属医院肿瘤科 郑州 4500522)焦作市第二人民医院肿瘤科 焦作 454002

关键词全反式维甲酸；LY294002；EC1细胞；PI3K；MMP-2

摘要目的：探讨全反式维甲酸(ATRA)、磷脂酰肌醇激酶-3(PI3K)抑制剂LY294002单独或联合作用对食管癌EC1细胞增殖、迁移及PI3K和MMP-2表达的影响。方法：将常规培养的EC1细胞随机分为ATRA组、LY294002组、ATRA+LY294002组和对照组4组，采用CCK-8检测各组细胞的增殖情况，通过划痕实验测定各组细胞的迁移能力，采用RT-PCR和Western blot方法检测各组细胞中PI3K及MMP-3 mRNA和蛋白的表达情况。结果：作用24、48和72 h后，ATRA+LY294002组的细胞增殖抑制率均高于其他2组(P<0.05)；作用24 h后，ATRA+LY294002组细胞迁移能力均低于其他3组(P<0.05)；作用48 h后，ATRA+LY294002组细胞PI3K及MMP-2 mRNA和蛋白的表达量均低于其他3组(P<0.05)。结论：ATRA联合LY294002可协同抑制EC1细胞的增殖、迁移和PI3K、MMP-2的表达，进而可能协同抑制肿瘤血管生成。

AbstractAim: To investigate effects of all-trans retinoic acid(ATRA)，LY294002 alone or combined on proliferation，migration and phosphoinositide 3-kinase(PI3K)，matrix metalloproteinase-2(MMP-2) expressions of EC1 cells in vitro.Methods: The cultured EC1 cells were randomly allocated into four groups: ATRA group, LY294002 group, ATRA plus LY294002 group and control group. The proliferation rate was detected by CCK-8 assay. Wound healing assay was used to observe the migration rate. The mRNA and protein expressions of PI3K and MMP-2 in the cells were detected by RT-PCR and Western blot assay.Results: The cell proliferation inhibition rate of ATRA plus LY294002 was higher than those of the other three groups after 24,48, and 72 h treatment(P<0.05). The migration rate of ATRA plus LY294002 group was lower than those of the other three groups after 24 h treatemnt(P<0.05). The relative expressions of PI3K and MMP-2 mRNA and protein of ATRA plus LY294002 group were lower than those of the other three groups after 48 h treatment(P<0.05).Conclusion: ATRA combined with LY294002 could inhibit EC1 cells′ proliferation, migration and the expressions of PI3K and MMP-2, which may be related to the inhibition of tumor angiogenesis.

研究[1]发现肿瘤新生血管的生长是恶性肿瘤复发、转移的重要因素之一，当肿瘤超过2 mm3时，要维持其生长则需要新生血管或血管生成拟态(VM)来维持肿瘤细胞的血液供应。另有研究[2-5]表明，在多种实体肿瘤如侵袭性卵巢癌、炎性乳腺癌、恶性胶质瘤、喉头鳞状细胞癌等肿瘤组织中发现VM的存在。磷脂酰肌醇激酶-3(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)信号通路在VM形成中有着重要的作用。PI3K及其下游MMPs家族可调控VM的形成，与肿瘤细胞的增殖、迁移、VM及细胞外基质(ECM)降解等相关[6-8]。全反式维甲酸(ATRA)作为重要的诱导分化剂已经成功应用于临床，有研究[9-10]发现ATRA能够抑制食管癌细胞的增殖、迁移。该研究通过体外选用ATRA及PI3K抑制剂LY294002作用于食管癌EC1细胞系，观察对细胞的增殖、迁移以及PI3K、MMP-2 mRNA和蛋白表达的影响，探索ATRA、LY294002单药或联合作用能否抑制食管癌细胞VM，为食管癌抗血管治疗提供理论依据。

1材料与方法

1.1主要药物和试剂RPMI 1640培养基、DMSO为北京索莱宝科技有限公司产品，胎牛血清为杭州四季青公司产品，ATRA(用无水乙醇配制成1 mmol/L的储备液，4 ℃避光保存)为美国Sigma公司产品，LY294002为碧云天生物科技有限公司产品，CCK-8试剂为日本同仁公司产品；兔抗人PI3K、MMP-2抗体购自美国Abcam公司，TRIzol购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒购自日本TaKaRa，PCR试剂购自北京康为世纪生物技术有限公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成。

1.2细胞培养及分组EC1细胞由郑州大学基础医学院肿瘤实验室赠送。EC1细胞单层贴壁生长于含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中常规培养，隔日换液，取对数生长期细胞进行实验。将实验传代的EC1细胞随机分为3组：ATRA组(ATRA终浓度为10 μmol/L)、LY294002组(LY294002终浓度为30 μmol/L)、ATRA+LY294002组，同时设对照组(只含细胞)。

1.3各组细胞增殖抑制率的CCK-8法检测取对数生长期细胞，经胰蛋白酶消化后，调整细胞悬液密度为5×104个/mL，接种于96孔培养板内，每孔100 μL，待细胞贴壁后吸去原培养液，按1.2分组培养，每组设6个平行孔，分别培养24、48和72 h，每24 h取出一个培养板，每孔加入CCK-8试剂(5 g/L)10 μL，继续孵育2～4 h后，选择450 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度(OD)值，记录结果。然后按[(OD对照孔-OD实验孔)/(OD对照孔-OD空白孔)]×100%公式计算细胞增殖抑制率。

1.4各组细胞迁移能力的划痕实验检测取对数生长期细胞，胰酶消化后以5×105个/孔接种于6孔板中，每孔加2 mL单细胞悬液，培养24 h后，用无菌枪头沿细胞中部划一条直线，继续培养。按1.2分组处理，每组设6个平行孔。分别在0、12和24 h拍照，用图像处理软件测量划痕宽度，按(1-实验组/对照组)×100%计算细胞迁移率。

1.5各组细胞中PI3K和MMP-2 mRNA表达的RT-PCR法检测收集各组培养48 h后的细胞(1×106个/mL)，PBS洗3次，TRIzol法提取细胞总RNA，用紫外分光光度法检测总RNA的纯度及浓度，15 g/L琼脂糖凝胶电泳测定RNA的完整性。将纯度合格的总RNA稀释成500 μg/L后取1 μL总RNA，按反转录反应试剂盒说明书进行反转录获得cDNA，以cDNA为模板进行PCR：cDNA模板1 μL，Taq PCR Master Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，用无RNA酶水补足反应体系50 μL。PI3K上游引物：5’-GAATCAGAACAATGCCTCCA-3’，下游引物：5’-CTTCACGGTTGCCTACTGGT-3’，扩增产物大小为339 bp；MMP-2上游引物：5’-ACTTAGACCGCTTGGCTTCA-3’，下游引物：5’-TCTGGTTCTTGTCCCACTTG-3’，扩增产物大小为378 bp；GAPDH上游引物：5’-TGATTC CACCCATGGCAAATTCC-3’，下游引物：5’-ACAGCCT TGGCAGCGCCAGTAGA-3’ ，扩增产物大小为504 bp。PI3K、MMP-2和GAPDH扩增条件：94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环30次；最后再72 ℃延伸10 min。循环完成后取10 μL PCR产物，10 g/L琼脂糖凝胶中电泳后，溴化乙锭紫外灯下观察并拍照。用Gel Analyzer 软件对结果进行灰度值分析。以目的条带与GAPDH条带灰度值之比作为目的基因mRNA的相对表达量。

1.6各组细胞中PI3K及MMP-2蛋白表达的Western blot 检测收集各组培养48 h后的细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。配置10%分离胶和5%浓缩胶，上样，蛋白电泳、转膜、封闭，加入兔抗人PI3K、MMP-2及β-Tublin一抗(均按11 000稀释)，4 ℃孵育过夜。次日取出膜片，TBST溶液中洗涤3次，5 min/次，分别加入HRP标记的二抗(按12 000稀释)室温、水平摇床上孵育1 h，暗室ECL发光液发光，显影、定影并测定。利用Image J软件进行灰度分析，以目的条带和β-Tublin条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.7统计学处理采用SPSS 17.0进行分析，应用单因素方差分析比较同一时间点不同组别细胞增殖抑制率的差异；应用2×2析因设计的方差分析比较不同组间迁移能力、PI3K、MMP-2 mRNA及蛋白表达量的差异。检验水准α=0.05。

2结果

2.1ATRA、LY294002对EC1细胞增殖的影响见表1。

表1　各组药物作用不同

*：与其他2组相比，P均<0.05。

A：对照组；B：ATRA组；C：LY294002组；D：ATRA+LY294002组。图1　各组EC1细胞划痕后培养24 h的迁移情况(×200)

2.2细胞迁移实验结果见图1。实验结果表明，划痕后培养24 h，ATRA+LY294002组细胞迁移能力[(24.63±1.74)%]较对照组[(74.50±1.06)%]及单药组[(50.43±1.36)%和(50.36±0.79)%]明显减弱，差异具有统计学意义(FATRA=105.164，FLY294002=97.670，F交互=73.082；P均<0.001)。

2.3各组细胞中PI3K和MMP-2 mRNA及蛋白的表达结果见图2、3和表2。

M：Marker；A：对照组；B：ATRA组；C：LY294002组；D：ATRA+LY294002组。 图2　各组细胞培养48 h后PI3K、MMP-2 mRNA表达的结果

A：对照组；B：ATRA组；C：LY294002组；D：ATRA+LY294002组。图3　各组细胞培养48 h后PI3K及MMP-2蛋白表达的结果

表2　各组细胞培养48 h后PI3K、MMP-2 mRNA及蛋白的表达结果(n=6)

3讨论

食管癌是发病率高、预后较差的实体瘤之一。食管癌患者在确诊时多数已属于晚期，失去手术治疗机会，目前多采用放疗联合化疗等综合治疗措施来控制疾病，但是其复发率和转移率居高不下，成为威胁食管癌患者生存的重要因素之一。复发和转移是恶性肿瘤最重要的生物学特性，是患者治疗失败以致死亡的重要原因，而肿瘤新生血管的生长则是恶性肿瘤复发、转移的重要因素之一。有研究[11]表明短期抗血管内皮因子治疗，可通过诱导VM的形成来促进肿瘤转移，可见靶向VM治疗显得尤为重要。研究发现[6-12]肿瘤ECM重塑是VM形成过程中的重要改变，而参与ECM重塑的主要是PI3K信号通路。该信号通路与肿瘤细胞的血管生成、侵袭、转移等密切相关[8]。PI3K是细胞内重要的信号传导分子，能够调控VM，与肿瘤细胞的迁移、黏附，肿瘤血管生成以及ECM降解等相关。一些可以形成VM的恶性肿瘤高度表达PI3K,其上游分子(如VE-cadherin)通过级联反应激活PI3K，进而调节膜型-基质金属蛋白酶1(MT1-MMP)的功能，MT1-MMP协同金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-2)活化基质金属蛋白酶2(MMP-2)，而激活的MMP-2作为PI3K下游分子，是一种重要的ECM降解酶，降解细胞外基质中层粘连蛋白5γ2链裂解为γ2’和γ2x片段，裂解片段沉积于ECM，参与基质重塑及ECM的形成[6-13]。因此应用PI3K特异性抑制剂LY294002可以通过抑制PI3K及其下游分子MMP-2的表达及活性进而抑制ECM重塑，减少VM的生成，进而影响肿瘤的生长、侵袭和转移。

ATRA是迄今为止研究最为深入、作用最强的分化诱导剂之一，最初应用于白血病细胞的诱导分化成熟。有研究[14]表明ATRA能显著降低胶原Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、纤维结合素及层粘连蛋白的合成，降低肿瘤细胞的转移和侵袭能力。近来有学者[15]将ATRA作用于消化道实体瘤如：食管癌、胃癌、结肠癌细胞等，发现ATRA通过影响Bcl-2/Bax、Survivin等蛋白的表达，抑制食管癌细胞的活性及诱导其凋亡。多数学者[16-17]研究发现ATRA能通过PI3K信号通路促进肿瘤细胞的凋亡，并可抑制VEGF、MMPs等相关因子的表达[18-19]，而VEGF亦可通过调节MMPs的表达及活性而影响血管重塑和血管密度[20]。但是ATRA对可能抑制肿瘤VM生成的相关分子靶向机制仍不明。

该实验结果显示，ATRA和LY294002联合作用于EC1细胞，细胞增殖抑制率明显高于各单药作用及对照组；划痕实验结果显示ATRA和LY294002均能降低EC1细胞的迁移能力，但是两药联合作用更加明显；RT-PCR及Western blot检测结果显示，ATRA和LY294002联合应用下调PI3K及MMP-2 mRNA和蛋白表达的能力较单药应用更加显著。

综上所述，ATRA和LY294002均能够抑制EC1细胞的生长，可能与下调PI3K及MMP-2 mRNA和蛋白表达有关，两者联合应用可以下调PI3K和MMP-2的表达，协同抑制PI3K信号通路，进而抑制肿瘤VM，为食管癌的治疗带来一定的希望。

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(2015-04-22收稿责任编辑赵秋民)

*河南省科技攻关计划项目112102310154

Effect of all-trans retinoic acid combined with LY294002 on proliferation,migration and expressions of PI3K and MMP-2 in EC1cells

CUIHuijuan1)，LINa1)，LUYanjuan1)，LIShanshan1)，WANGZhenzhen2)，LUTaiying1)

1)DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)DepartmentofOncology,theSecondPeople′sHospitalofJiaozuoCity,Jiaozuo454002

Key wordsall-trans retinoic acid；LY294002；EC1 cell；phosphoinositide 3-kinase；matrix metalloproteinase-2

中图分类号R735.1

通信作者#，女，1966年9月生，博士，教授，研究方向：恶性肿瘤的临床综合治疗，E-mail:wanlucying@163.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.001