河南汉族男性原发性不育与SHBG基因启动子(TAAAA)n多态性的关联性*

温胜兰，谢　诗，王志伟，何　诺,李兴武,陈　辉

1)郑州大学临床医学系 郑州 450052　2)郑州市中心医院检验科 郑州 450007　3)郑州大学第一附属医院检验科 郑州 450052　4)郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室 郑州 450001



河南汉族男性原发性不育与SHBG基因启动子(TAAAA)n多态性的关联性*

温胜兰1)，谢诗1)，王志伟1)，何诺2),李兴武3)#,陈辉4)#

1)郑州大学临床医学系 郑州 4500522)郑州市中心医院检验科 郑州 4500073)郑州大学第一附属医院检验科 郑州 4500524)郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室 郑州 450001

关键词性激素结合球蛋白；(TAAAA)n多态性；男性原发性不育；河南汉族

摘要目的：探讨河南汉族男性原发性不育与性激素结合球蛋白(SHBG)基因启动子(TAAAA)n多态性的关联性。方法：分别收集288例河南汉族男性原发性不育患者和259例正常男性的精液或血液，酚-氯仿法提取DNA，PCR扩增目的片段，检测Y染色体微缺失，对无缺失个体进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染及生物测序分析SHBG基因启动子(TAAAA)n等位基因和基因型。结果：病例组Y染色体微缺失率为12.15%(35/288)，对照组未检出。检测到(TAAAA)五核苷酸5～10次重复、6个等位基因及20种基因型。病例组与对照组(TAAAA)n多态性构成比较，差异有统计学意义(P<0.001)。其中，n=5、6、7、10时，2组间比较差异无统计学意义(P均>0.008)；n=8为保护因素(P=0.002)，n=9为危险因素(P<0.001)；n≥9时增加了原发性不育的风险(P<0.001)。结论：河南汉族男性原发性不育与SHBG基因启动子(TAAAA)n多态性可能有一定关联性。

AbstractAim: To investigate the association of the (TAAAA)n polymorphism in the sex hormone-binding globulin (SHBG) gene promoter with idiopathic male infertility in Henan Han population.Methods: Semen samples of 288 men with idiopathic infertility and blood samples of 259 normal controls were collected. Genomic DNA was extracted by phenol-chloroform method and target fragment was amplified by PCR. The Y-chromosome microdeletion was examined in all samples.The gene polymorphism was obtained by PAGE, silver staining method, and biological sequencing in the group without Y-chromosome microdeletion.Results: Y-chromosome microdeletion were detected in 12.15%(35/288) infertile men,while not found in controls. Six alleles containing (TAAAA) 5-10 repeats and 20 genotypes were presented in the subjects. The constituent ratio of (TAAAA)n polymorphism between the cases and controls was different(P<0.001).When n=5, 6, 7, 10，there was no significant difference(P>0.008).n=8 was a protective factor(P=0.002),and n=9 was a dangerous factor(P<0.001).n≥9 increased risk of infertility(P<0.001).Conclusion: There may be some correlation between the (TAAAA)n polymorphism in the SHBG gene promoter with idiopathic male infertility.

性激素结合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)是由肝脏分泌的一种同型二聚体糖蛋白，可与血液循环中的类固醇激素特异性结合、转运，调节血浆中性激素游离浓度和生物活性[1]。SHBG基因位于17p12-p13，由8个外显子和7个内含子组成，编码402个氨基酸多肽，(TAAAA)n重复序列位于SHBG基因启动子区，距离起始密码约700 bp。该五核苷酸(TAAAA)重复次数为6～10次[2]，其多态性可以反映血液循环中SHBG水平，进而影响性激素水平，并可能与男性不育有关。该研究旨在通过检测河南汉族男性SHBG基因启动子(TAAAA)n多态性，探讨其与男性原发性不育的关系。

1对象与方法

1.1研究对象病例组：收集2013年1月至6月在郑州大学第一附属医院生殖中心及检验科门诊因不育而就诊的288例患者，年龄22～45(32.4±6.4)岁。患者均经过至少2次按照WHO公布的标准进行的精液常规分析, 并排除明确病理原因以及服用抗肿瘤药物等情况，均确诊为无精子或少精子病(精子密度<20×106mL-1)。对照组：选取健康且已通过正常途径生育至少1个孩子的正常男性259例作为对照，年龄24～45(32.8±6.7)岁。2组均为河南汉族人，且均签署知情同意书。

1.2DNA提取采用常规酚-氯仿法，从病例组的精液和对照组的血液中提取DNA，-20 ℃保存。

1.3Y染色体微缺失检测Y染色体长臂远端AZF区域微缺失可导致生精障碍，为排除其对男性原发性不育的影响，首先对病例组和对照组进行Y染色体AZF微缺失检测。选择3个Y染色体AZF区系列标签位点，分别为AZFa区的SY86、AZFb区的SY127和AZFc区的SY254，SRY和ZFY作为内对照。引物序列见表1。PCR反应体系(20 μL)：上、下游引物各0.5 μmol/L、Taq DNA聚合酶1 U、0.3 mmol/L dNTP、2.5 mmol/L MgCl2、10×PCR Buffer 2.0 μL、DNA模板0.2～0.5 μg，灭菌双蒸水补足体积。PCR扩增条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，59 ℃复性45 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。琼脂糖凝胶电泳：配制15 g/L的琼脂糖凝胶，其中加入4 μL染色剂EB，待其凝固，拔掉梳子，置入0.5×TBE缓冲液中。取6 μL PCR扩增产物加样，于120 V电泳约45 min[3]。紫外灯下观察并记录结果。

表1　Y染色体微缺失检测引物序列及扩增产物大小

1.4(TAAAA)n多态性的检测对检测无微缺失的样本进行PCR扩增。引物序列为，正义5’-TC CCAACTACTAAGGAGGCTGAGACA-3’，反义5’-CGCCTCTCAGTTATCTTCCCTTATCC-3’。PCR反应体系(16 μL)：DNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L),PCR Mix 8 μL,灭菌双蒸水补足体积。PCR扩增条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性40 s， 59 ℃复性40 s， 72 ℃延伸40 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min。取PCR产物8 μL和2×Loading Buffer等体积混合后，上样于60 g/L变性聚丙烯酰胺凝胶，于35 W预电泳30 min，然后30 W电泳2 h，最后用银染显色。记录每一种基因型出现的频率并进行分析，将不同基因型送至金唯智生物公司进行DNA测序验证。

1.5统计学处理应用HWE 1.20对样本进行Hardy-Weinberg平衡检验。STR多态性检测以(TAAAA)的重复次数n为依据，以n命名等位基因。采用SPSS 17.0进行数据分析，病例组与对照组间(TAAAA)n多态性构成比较、等位基因不同重复次数分层组间比较和分割位点分析均采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2结果

2.1Y染色体微缺失检测结果见图1。病例组288例中检测出Y染色体微缺失35例，缺失率为12.15%；其中，AZFa微缺失3例，AZFb微缺失8例，AZFc微缺失17例，AZFac微缺失1例，AZFbc微缺失6例。对照组未检测出Y染色体微缺失。

M：Marker；1：AZFc微缺失；2：AZFa微缺失；3：AZFb微缺失；4：AZFac微缺失；5：AZFbc微缺失；6：正常男性；7：正常女性；8：水。图1　Y染色体微缺失检测结果

2.2(TAAAA)n基因型分布在排除了Y染色体微缺失的病例组和对照组中，共检测到五核苷酸(TAAAA)片段5～10次重复(即6个等位基因：5、6、7、8、9、10 )和20种基因型(5/5、5/6、5/7、5/8、5/9、6/6、6/7、6/8、6/9、6/10、7/7、7/8、7/9、7/10、8/8、8/9、8/10、9/9、9/10、10/10)，结果见图2。对照组人群Hardy-Weinberg平衡检验结果为，χ2=23.982，P=0.065，具有较好的群体代表性。基因型9/9、8/8、7/7测序结果见图3。

2.3(TAAAA)n多态性分析病例组与对照组(TAAAA)n多态性构成比较，差异有统计学意义(表2)；其中，n=5、6、7、10时，2组间比较差异无统计学意义，n=8为保护因素，n=9为危险因素(表3)；因此，以9次重复作为分割位点划分等位基因，将研究对象分为短链组(n<9)和长链组(n≥9)。n≥9时可增加原发性不育的风险(表4)。

LⅠ、LⅡ：Ladder，从下向上依次表示(TAAAA)重复次数为6、7、8、9；1、8：6/6；2：8/8；3、10：7/9；4：7/7；5、6、9：9/9；7：6/8；11：水；12：6/9。图2　(TAAAA)n多态性检测结果

图3　基因型9/9(上)、8/8(中)、7/7(下)测序图

表2　2组(TAAAA)n多态性构成比较

χ2=27.762，P<0.001。

表3　2组各等位基因构成比较

α′=0.05/6=0.008。

表4　分割位点法分析结果

χ2=20.577，P<0.001，OR=1.800，95%CI=1.396～2.320。

3讨论

近年来，男性不育困扰着越来越多的适龄夫妇，并给社会带来了许多负面影响。我国不孕不育症的发生率大约为20%，其中男方因素约占30%，主要表现为生精障碍[4]。随着科学技术的进步，基因检测可能成为发现病因的主要手段，已证实谷胱甘肽S-转移酶[5]和细胞色素P4501A1[6]等的基因多态性严重影响了精液质量。

SHBG在卵巢、子宫内膜、胎盘和睾丸中均有表达，其水平的异常变化和动脉粥样硬化[7]、代谢综合征[8]、女性不孕症[9]等疾病的发生有关，近年发现它与男性不育症可能也存在关联。Eriksson等[10]以(TAAAA)重复次数为连续参数进行分析发现，SHBG聚集水平与(TAAAA)n的n值呈负相关。Lazaros等[11]发现正常男性与不育男性相比有较低的SHBG(TAAAA)重复次数和较高的精液浓度。Safarinejad等[2]证实，SHBG基因(TAAAA)n多态性和Asp327Asn多态性与循环血液中SHBG的浓度及男性原发性不育有关，不育的风险随(TAAAA)n中n值的增大而增加，且n≤8时明显降低了男性不育的风险，n>8时增加了其风险。

该研究中作者发现(TAAAA)n重复次数为5～10，共6个等位基因，这与Safarinejad等[2]发现的重复6～10次、共5个等位基因略有差异，可能与人种差异和研究样本量有关。n=5、6、7、10时，病例组和对照组比较差异无统计学意义，n=8为保护因素，n=9为危险因素，n≥9时增加了原发性不育的风险。基于该研究结果，作者推测:①SHBG启动子的转录活性与(TAAAA)重复次数有关，长链组(n≥9)人群循环血液中SHBG浓度可能降低，从而提高了原发性不育的风险，对于超促排卵的女性[8]和具有正常生育能力男性[9]的研究结果也呈现类似规律。②SHBG基因可能与其他影响男性精液质量的基因多态连锁，也可能与SHBG结合靶组织的细胞膜受体活性及性激素的生物利用度有关，故(TAAAA)n与患病风险不一定呈严格的线性关系，这一现象在国外学者类似研究中也有反映：在患糖代谢综合征的男性人群中,发现(TAAAA)6等位基因与低血清SHBG水平相关[12]；在希腊绝经后女性中也观察到，携带(TAAAA)8等位基因的个体比携带(TAAAA)7等位基因的个体绝经年龄明显增大[13]。

综上所述，河南汉族男性SHBG基因启动子(TAAAA)n多态性与男性原发性不育可能有一定关联性。应该指出的是，该研究样本规模不足，检测对象是特定人群，故存在一定的局限性，仍需要进一步深入研究。

参考文献

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[3]崔元戎.Y染色体微缺失及SHBG基因多态性与河南汉族人群男性不育的相关性研究[D].郑州:郑州大学,2012.

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[13]MARKATSELI AE,HATZI E,PAMPORAKI C,et al.Association of the (TAAAA)n repeat polymorphism of SHBG gene with the age at menopause in Greek postmenopausal women[J].Maturitas,2014,78(2):113

*郑州大学大学生创新实验资助项目2013xjxm097

Association of (TAAAA)n polymorphism in SHBG gene promoter with idiopathic male infertility in Henan Han population

WENShenglan1),XIEShi1),WANGZhiwei1),HENuo2),LIXingwu3),CHENHui4)

1)DepartmentofClinicalMedicine,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)ClinicalLaboratory,ZhengzhouCentralHospital,Zhengzhou4500073)ClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500524)DepartmentofCellBiologyandMedicalGenetics,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

Key wordssex hormone-binding globulin;(TAAAA)n polymorphism;idiopathic male infertility;Henan Han population

中图分类号R394.3

通信作者：#陈辉，女，1968年5月生，博士，副教授，研究方向：遗传性疾病发病机制，E-mail：chenhui@zzu.edu.cn；李兴武，男，1963年9月生，硕士，主任技师，研究方向：临床检验，E-mail:lllixingwu@163.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.021