儿茶素对胃癌细胞SGC-7901和MGC-803迁移及侵袭的影响*

杜培培,刘宗文,张　艳#,张钰浩,尚淑芳,贾丹辉

1)郑州大学基础医学院药理学教研室 郑州 450001　2)郑州大学第二附属医院肿瘤放疗科 郑州 450014　3)郑州大学临床医学系 郑州 450052



儿茶素对胃癌细胞SGC-7901和MGC-803迁移及侵袭的影响*

杜培培1),刘宗文2),张艳1)#,张钰浩3),尚淑芳1),贾丹辉1)

1)郑州大学基础医学院药理学教研室 郑州 4500012)郑州大学第二附属医院肿瘤放疗科 郑州 4500143)郑州大学临床医学系 郑州 450052

关键词胃癌；酸敏感离子通道；阿米洛利；儿茶素

摘要目的：探讨儿茶素是否作用于酸敏感离子通道(ASICs)，进一步研究儿茶素是否通过ASICs对胃癌细胞迁移和侵袭产生影响。 方法：采用MTT法检测儿茶素(0、50、100、200、400 μmol/L)对胃癌细胞SGC-7901和MGC-803增殖的影响。将细胞分为对照组，100 μmol/L阿米洛利组，50、100、200 μmol/L儿茶素组，采用免疫细胞化学方法检测ASIC1的表达情况，Transwell实验和划痕实验检测细胞的迁移和侵袭情况。采用全细胞膜片钳技术观察对照组、100 μmol/L阿米洛利组、400 μmol/L儿茶素组细胞的电流情况。 结果：ASIC1在各组细胞中均有表达，并且与SGC-7901细胞相比， MGC-803细胞中ASIC1的表达较低(P<0.05)；与对照组相比，儿茶素可以抑制ASIC1的表达，并且儿茶素的抑制作用弱于阿米洛利的抑制作用(P均<0.05)。与SGC-7901细胞相比，MGC-803细胞的侵袭和迁移能力较弱(P均<0.05)；与对照组相比，儿茶素可减弱2种胃癌细胞的侵袭能力和迁移能力，并且儿茶素的抑制作用弱于阿米洛利的抑制作用(P均<0.05)。MGC-803细胞的ASICs电流小于SGC-7901细胞的ASICs电流(P<0.05)；与对照组相比，儿茶素可使ASICs电流减弱，并且儿茶素的抑制作用弱于阿米洛利的抑制作用(P均<0.05)。结论：儿茶素可以通过抑制ASICs的表达抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。

AbstractAim: To investigate the effects of catechin on ASICs, and explore the effects of catechin on invasion and metastasis of gastric carcinoma cells． Methods: The SGC-7901 and MGC-803 cells were treated with 0,50,100,200,and 400 μmol/L catechin and the proliferation of the cells were observed by MTT.The SGC-7901 and MGC-803 cells were allocated into control group, 100 μmol/L amiloride group, 50, 100, 200 μmol/L catechin groups;the expression of ASIC1 protein was detected by immunocytochemistry,and the changes of cell invasion and metastasis were detected by wound-healing migration assay and Transwell migration assay, respectively. Finally, the ASICs current was analyzed by the whole cell patch clamp.Results: Expression of ASIC1 protein in MGC-803 cells was lower that in SGC-7901 cells(P<0.05).Compared with the control group, catechin reduced ASIC1 expression,and the inhibitive effect of catechin on ASIC1 expression was weaker than that of Amiloride (P<0.05). The invasion and metastasis ability of MGC-803 cells were weaker than that of SGC-7901 cells(P<0.05).Compared with the control group,catechin could reduce invasion and metastasis ability of MGC-803 and SGC-7901 cells, and the inhibitive effect of catechin was weaker than that of Amiloride(P<0.05). The ASICs current of MGC-803 was lower than that of SGC-7901 cells(P<0.05).Compared with the control group,catechin could reduce ASICs current of MGC-803 and SGC-7901 cells,and the inhibitive effect of catechin was weaker than that of Amiloride(P<0.05).Conclusion: Catechin could inhibit invasion and metastasis ability of gastric carcinoma cells by reducing the expression of ASICs.

胃癌是常见的恶性肿瘤之一,复发率很高。研究[1]表明，胃癌的生物学行为与某些分子指标有关。胃癌侵袭转移的程度是影响预后的主要因素[2],而肿瘤转移的特性是肿瘤治疗的难点[3]。肿瘤细胞的侵袭和转移是一个复杂和多步骤的连续发展过程[4]。研究[5]表明，组织酸化在肿瘤细胞的侵袭和转移中起着至关重要的作用，而酸敏感离子通道(ASICs)是细胞膜上一类可以被酸性溶液直接激活的通道蛋白，抑制ASICs表达可以抑制胶质瘤细胞的侵袭转移；阿米洛利作为ASICs的抑制剂可以减弱胶质瘤细胞的侵袭转移。儿茶素是一种黄烷醇类化合物，具有较明显的抗癌作用[6]，可抑制肿瘤增殖，促进肿瘤细胞的凋亡[7-10]；同时也可抑制肿瘤细胞的侵袭转移[11-13]。该研究采用全细胞膜片钳方法及体外侵袭生物学实验观察儿茶素对ASICs的作用，以及对胃癌细胞侵袭和迁移能力的影响，从而为儿茶素治疗胃癌提供新的理论依据。

1材料与方法

1.1细胞与试剂胃癌细胞(SGC-7901、MGC-803)由河南省医学研究所馈赠。ASIC1抗体(北京博奥森生物有限公司)，阿米洛利、儿茶素(美国Sigma公司)。

1.2MTT法检测胃癌细胞的生存率将2种胃癌细胞分别以 5×104mL-1接种在96孔板中；24 h后换为无血清DMEM高糖培养液，调整儿茶素浓度为0(对照)、50、100、200、400 μmol/L，各浓度设定培养时间为24 h；终止培养前4 h，每孔加20 μL MTT、150 μL二甲基亚砜，30 min后用酶标仪(检测波长为490 nm)检测各孔吸光度值,以对照组的细胞生存率为1计算2种细胞的生存率。实验重复3次。

1.3免疫细胞化学方法检测ASIC1的表达将2种胃癌细胞培养于24孔板中，调整阿米洛利终浓度为100 μmol/L，儿茶素终浓度为50、100、200 μmol/L，另设对照组和阴性对照组，培养48 h后用40 g/L的多聚甲醛固定20 min；按SP试剂盒说明进行操作；每张爬片观察5个高倍视野,阳性细胞的胞膜和胞质为棕黄色，胞核为蓝色，计数100个细胞中的阳性细胞数，计算阳性率。实验重复3次。

1.4细胞迁移能力的测定参照文献[14]，取2种胃癌细胞按每孔5×105个细胞接种于6孔板，划痕，PBS清洗。加入含药或者不含药的无血清培养基(分组同1.3)，在 0、24 h 分别于倒置显微镜下拍照，与0 h比较计算24 h细胞迁移的距离，以SGC-7901对照组细胞的迁移率为1计算各组细胞的迁移率。实验重复3次。

1.5细胞侵袭能力的测定参照文献[15]，细胞分组同1.3，每孔加入16稀释胶40 μL，放入37 ℃培养箱中30 min；调整细胞密度为1×106mL-1，每孔加200 μL细胞悬液；24孔板下室加含体积分数30%新生牛血清的DMEM培养基600 μL；200倍镜下每孔取5个视野拍照，记录穿膜细胞数并求平均值。实验重复3次。

1.6全细胞膜片钳观察细胞的ASICs电流将细胞分为对照组、100 μmol/L阿米洛利组和400 μmol/L儿茶素组，培养24 h，待细胞贴壁且状态良好时进行检测。电极内液包含：100 mmol/L葡萄糖酸钾、30 mmol/L KCl、10 mmol/L NaCl、20 mmol/L HEPES、0.5 mmol/L EGTA、4 mmol/L ATPNa2；细胞外液包含：125 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、1.2 mmol/L MgSO4、1 mmol/L CaCl2、1 mmol/L NaH2PO4、10.5 mmol/L葡萄糖、32.5 mmol/L HEPES。实验时将细胞置于35 mm培养皿中，加入细胞外液1 mL，放置在倒置显微镜平台上；使充满电极内液的玻璃微电极尖端吸附在细胞膜上，给予负压，电压钳制在-60 mV,破膜5 min后开始检测电流。实验重复3次。

1.7统计学处理应用SPSS 19.0处理数据，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较各组细胞生存率、ASIC1阳性表达率、迁移侵袭能力、ASICs电流的差异，检验水准α=0.05。

2结果

2.1MTT法检测不同浓度的儿茶素对胃癌细胞生存率的影响结果见表1。

表1　各组细胞生存率的比较(n=3)　%

*：与对照组相比，P<0.05。

A:对照组;B:阴性对照组;C:100 μmol/L阿米洛利组;D:50 μmol/L儿茶素组;E:100 μmol/L儿茶素组;F:200 μmol/L儿茶素组。图1　各组SGC-7901细胞中ASIC1的表达(SP，×400)

2.2各组细胞中ASIC1的表达情况结果见图1、2和表2。

A:对照组;B:阴性对照组;C:100 μmol/L阿米洛利组;D:50 μmol/L儿茶素组;E:100 μmol/L儿茶素组;F:200 μmol/L儿茶素组。图2　各组MGC-803细胞中ASIC1的表达(SP，×400)

表2　各组细胞ASIC1阳性表达率的比较(n=3)　%

*：与对照组相比，P<0.05；#：与100 μmol/L阿米洛利组相比，P<0.05；▲：与SGC-7901对照组相比，P<0.05。

2.3各组细胞迁移能力的比较结果见表3。

表3　各组细胞迁移率的比较(n=3)　%

*：与对照组相比，P<0.05；#：与100 μmol/L阿米洛利组相比，P<0.05；▲：与SGC-7901对照组相比，P<0.05。

2.4各组细胞侵袭能力的比较结果见表4。

表4　各组细胞侵袭能力的比较(n=3)

*：与对照组相比，P<0.05；#：与100 μmol/L阿米洛利组相比，P<0.05；▲：与SGC-7901对照组相比，P<0.05。

2.5各组细胞ASICs电流强度的比较结果见表5。

表5　各组细胞ASICs电流强度的比较(n=3)　pA

*：与对照组相比，P<0.05；#：与100 μmol/L阿米洛利组相比，P<0.05；▲：与SGC-7901对照组相比，P<0.05。

3讨论

胃癌的复发率和病死率较高，其中胃癌的侵袭转移是导致其复发的主要原因。侵袭转移是恶性肿瘤的重要生物学行为,是影响抗肿瘤治疗及预后的重要因素之一[16]。ASICs是细胞膜上由细胞外H+直接激活的通道蛋白，目前，已有6个ASICs亚基被克隆，分别是 ASIC1a、1b、2a、2b、3和4[17]。研究[18]表明其在脑缺血等伴有组织酸化的病理状态中发挥作用，当脑缺血发生时，细胞周围的pH从7.4降至6.0甚至更低，这样就刺激ASIC1a开放，介导钙内流，诱导神经元凋亡从而促使神经元损伤。研究[19]表明，组织酸化和乏氧是肿瘤微环境的重要生物学特征。肿瘤的微环境乏氧和酸化与脑缺血组织酸化具有相似的病理基础。ASICs在神经胶质瘤细胞中有表达，它的表达与神经胶质瘤的发生发展密切相关[20]。也有研究[21]发现在腺样囊性癌细胞和组织中均有ASICs的表达，但是在正常组织中并未见ASICs的明显表达。

该研究中免疫细胞化学检测结果显示，在2种胃癌细胞SGC-7901和MGC-803中均有ASIC1的表达，说明ASICs可能与胃癌的发生发展有一定关系；SGC-7901细胞是中分化高转移胃癌细胞，而MGC-803细胞是低转移胃癌细胞，2种细胞的侵袭转移能力有差别，推测胃癌细胞的侵袭转移可能与ASICs的表达有一定关系。儿茶素是一种天然的植物提取药物，有潜力成为抗癌药物[22]，它可以抑制脑胶质瘤细胞U215的增殖[23], 在一定程度上也可抑制人肝癌细胞的增殖和迁移并诱导其凋亡[24]。该研究结果表明，儿茶素可以抑制胃癌细胞ASIC1的表达，减弱ASICs电流，并且还可抑制细胞的转移和侵袭。这为临床上采用儿茶素治疗胃癌提供了一定的理论依据，但是具体机制还有待进一步的研究。

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Effects of catechin on invasion and metastasis in gastric carcinoma cells SGC-7901 and MGC-803

DUPeipei1),LIUZongwen2),ZHANGYan1),ZHANGYuhao3),SHANGShufang1),JIADanhui1)

1)DepartmentofPharmacology，CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)DepartmentofRadiationOncology,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500143)DepartmentofClinicalMedicine,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

*河南省高等学校重点科研项目基础研究计划基金资助项目15A310031；郑州市科技创新团队基金资助项目131PCXTD628

Key wordsgastric carcinoma;ASICs;amiloride;catechin

中图分类号R735.2

通信作者#，女，1968年4月生，博士，教授，研究方向：肿瘤药理学，E-mail:zhangyan055@zzu.edu.cn

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.013 [8]RATHORE K,CHOUDHARY S,OA,et al.Green tea catechin intervention of reactive oxygen species-mediated ERK pathway activation and chronically induced breast cell carcinogenesis[J].Carcinogenesis,2012,33(1):174