豫医卷毛大鼠无毛基因cDNA序列的比较生物学分析*

张明昊，章金涛

1)河南中医学院基础医学院医学机能实验室 郑州 450046　2)郑州大学实验动物中心 郑州 450052

△男，1982年7月生，硕士，实验师，研究方向：动物遗传学，E-mail:zhangminghao@139.com



豫医卷毛大鼠无毛基因cDNA序列的比较生物学分析*

张明昊1)△，章金涛2)

1)河南中医学院基础医学院医学机能实验室 郑州 4500462)郑州大学实验动物中心 郑州 450052

△男，1982年7月生，硕士，实验师，研究方向：动物遗传学，E-mail:zhangminghao@139.com

关键词卷毛大鼠；无毛基因；同源性比较

摘要目的：对豫医卷毛大鼠的无毛(Hr)基因进行比较生物学分析。方法：采用PCR方法对豫医卷毛大鼠Hr基因的cDNA序列进行克隆、测序，并与BN大鼠、小家鼠、野猪、家牛、普通猕猴、人、黑腹果蝇和桔小实蝇的Hr 基因cDNA序列及其编码产物的氨基酸序列进行同源性比较和系统遗传学分析。结果：获得了豫医卷毛大鼠Hr基因全长5 232 bp的cDNA序列(GenBank登录号：KR109217)。豫医卷毛大鼠Hr cDNA与BN大鼠、小家鼠、野猪、家牛、普通猕猴、人、黑腹果蝇和桔小实蝇的同源性分别为99.8%、87.3%、67.3%、70.2%、80.8%、79.8%、29.8%和24.9%，氨基酸序列的同源性分别为100.0%、92.9%、75.4%、74.8%、76.0%、77.8%、7.4%和11.7%。结论：Hr基因在哺乳动物中具有一定的保守性，与昆虫等非哺乳类动物之间具有较大的差异性。

AbstractAim: To study the difference of hairless (Hr) gene and its coding between Yuyi curly hair rats and other species. Methods: PCR technique was developed to clone the sequence of cDNA of Hr gene from Yuyi curly hair rats, and biologic characters of nucleotide and amino acid sequence encoding Hr gene in different species(rattus norvegicus, mus musculus, sus scrofa, bos taurus, macaca mulatta, homo sapiens, D.melanogaster and Bactrocera dorsalis) were analyzed.Results: The full-length of cDNA sequence of Hr gene from Yuyi curly hair rats was 5 232 bp(Accession Number: KR109217). The Hr gene nucleotide homology of Yuyi curly hair rats to rattus norvegicus, mus musculus, sus scrofa, bos taurus, macaca mulatta, homo sapiens, D.melanogaster and Bactrocera dorsalis was 99.8%, 87.3%, 67.3%, 70.2%, 80.8%, 79.8%, 29.8% and 24.9%, and that of amino acid sequences was 100.0%, 92.9%, 75.4%, 74.8%, 76.0%, 77.8%, 7.4% and 11.7%, respectively. Conclusion: A certain degree of conservation of Hr gene exists among different mammalian taxons, but there is some specificity from non-mammals.

无毛(hairless，Hr)基因是皮肤和被毛结构形成过程中重要的调节基因之一[1]，其编码的Hr蛋白在皮肤、脑、肠、肺、肌肉、垂体中表达，以皮肤和脑部的表达量较高，并在毛囊中呈现周期性的表达变化[2]。Hr蛋白的精确功能尚不完全清楚，但根据基因结构分析，推测其可能属于转录因子GATA家族，发挥转录抑制因子的作用，控制着动物出生后的第一次毛发生长周期转换，与毛囊生长退行期中角质细胞的凋亡有关[3-4]。有报道[5]指出，Hr基因12外显子上的第3 110位终止密码子突变会导致小鼠的皮肤和被毛结构发生异常改变，从而使小鼠出现类似人的丘疹性无毛症的表型。豫医卷毛大鼠(Yuyi curly hair rat，YCHR)是在SD大鼠繁殖种群中发现的一种被毛和胡须均发生弯曲的基因突变大鼠，经遗传测交实验证实该卷毛性状受常染色体上单一显性基因控制，呈现半显性遗传[6-7]。考虑到Hr基因在毛发生长发育过程中的生物学作用，作者克隆了YCHR Hr基因的cDNA序列，并与GenBank上发布的其他物种的Hr基因cDNA序列进行了同源性比较，以期进一步揭示该基因在生物体生长发育过程中的作用。

1材料与方法

1.1实验动物及主要试剂8周龄YCHR 10只，雌雄各半，由郑州大学实验动物中心提供，一级环境条件下饲养。Taq聚合酶、10×PCR Buffer (100 mmol/L Tris-HCl， pH 8.8，25 ℃；500 mmol/L KCl；体积分数0.8% Nonidet)、MgCl2(25 mmol/L)、dNTP(10 mmol/L)、DNA Marker、6×DNA Loading Dye、PCR产物纯化回收试剂盒等均购自上海生工生物工程技术服务公司。

1.2DNA的提取及处理处死YCHR后立即取脑组织，用液氮速冻后贮存于液氮罐中，用DNA提取试剂盒提取总DNA，-80 ℃冰箱中保存待用。

1.3Hr基因cDNA的扩增及测序根据GenBank上发表的大鼠Hr基因的cDNA序列(GenBank登录号：NM001276440)，采用DNAStar软件包的PrimerSelect程序设计了11对重叠引物(表1)。引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。PCR反应体系：模板DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，Taq Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，5 U/μL Taq聚合酶0.5 μL，ddH2O 35.5 μL，总体系为50 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，56～60 ℃退火35 s，72 ℃延伸50～90 s，共35个循环；最后72 ℃修复延伸8～10 min，4 ℃保存。然后，取PCR扩增产物在10 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳检测，并送上海生工生物工程技术公司双向测序。

表1　扩增Hr基因cDNA序列所用引物

1.4Hr基因cDNA序列的比较生物学分析将获得的cDNA序列在GenBank上进行BLAST初步比对分析，然后再根据序列重叠区域拼接YCHR Hr基因cDNA完整序列，并下载BN大鼠(GenBank登录号：U71293)、小家鼠(GenBank登录号：BC049182)、野猪(GenBank登录号：EF405626)、家牛(GenBank登录号：BC150129)、普通猕猴(GenBank登录号：AF361864)、人(GenBank登录号：AJ277165)、黑腹果蝇(GenBank登录号：X67239)和桔小实蝇(GenBank登录号：XM011207671)的Hr基因cDNA序列，采用DNAman和DNAStar软件进行同源性比对和系统遗传学分析。

2结果

2.1YCHR Hr基因cDNA的扩增PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，均得到明显特异性的目的条带，产物大小与预期结果相一致(图1)。测序结果经BLAST比对分析，确认为Hr基因序列。序列拼接显示YCHR Hr基因的完整cDNA序列长5 232 bp(GenBank登录号：KR109217)。

M:Marker;1～11：分别为Hr-1至Hr-11扩增产物。图1　YCHR PCR电泳结果

2.2Hr基因的比较生物学分析结果见表2、3，系统遗传分析结果见图2。Hr基因的系统遗传分析结果显示，YCHR与BN大鼠处于一个分支，和小家鼠的亲缘关系较近，野猪和家牛、人和普通猕猴分别处于独立分支，这些哺乳动物分支之间有70%左右的同源性;黑腹果蝇和桔小实蝇处于另外的独立分支。

表2　YCHR与其他物种Hr

1：YCHR； 2：BN大鼠(U71293)；3：小家鼠(BC049182)；4：野猪(EF405626)；5：家牛(BC150129)；6：普通猕猴(AF361864)；7：人(AJ277165)；8：黑腹果蝇(X67239)；9：桔小实蝇(XM011207671)。

表3　YCHR与其他物种

1：YCHR； 2：BN大鼠(AAC53018)；3：小家鼠(AAH49182)；4：野猪(ABN80094)；5：家牛(AAI50130)；6：普通猕猴(AAL56245)；7：人(CAB86602)；8：黑腹果蝇(CAA47664)；9：桔小实蝇(XP011205973)。

图2　Hr基因同源序列的进化分析

3讨论

借助于自发的或诱导的毛发缺陷动物(如无毛动物、卷毛动物等)，人们可以研究毛发的形成及基因型与表现型的关系，并帮助人们揭示脱发、卷发等毛发异常现象出现的原因[8]。小鼠的Hr基因序列是Cachon-Gonzalez等[3]联合运用PCR测序及外显子捕获技术确定的，而大鼠的Hr基因序列是在大鼠脑组织中克隆甲状腺激素反应相关基因时确定的[9]，它与小鼠的同源性较高，其编码产物均含有由6个半胱氨酸组成的潜在的DNA结合锌指结构域，对毛囊间上皮细胞的增殖、分化和凋亡及维持毛乳头与上皮结构的完整性具有重要的生物学作用[10]。Hr基因功能降低将直接导致毛母质细胞提前成熟并出现大量凋亡，毛囊随之解体；而Hr基因表达产物的缺失将导致毛囊外根鞘内发生凋亡的角化细胞数量增加，毛囊不能从出生后的第一次退行期中复苏，导致毛发无法重新生长和分化，与此同时，Hr蛋白的缺失还会使真皮乳头与其表面的毛囊上皮无法接触，从而使毛球细胞大量死亡，毛囊上皮转化为囊状物，临床表现为栗丘疹性的皮肤损伤[11-12]。Hr基因的突变一直是分子遗传学的研究热点，目前已发现了多种突变类型，如hairless(hrhr)突变、rhino hrrh突变、hrrh-J突变、hrrh Ch突变等，这些突变大多发生于小鼠，使突变小鼠脱去首次生长的被毛，出现类似于无毛小鼠的表型，而且随着年龄增长，皮肤会变得松弛冗长，逐渐加厚，形成犀牛状皱褶[13-15]。人Hr基因的多种形式的突变能导致伴丘疹性损害，出现先天性无毛症(atrichia with popular lesions，APL)和先天性普秃(alopecia universalis congenita，AUC)这两种遗传性皮肤病[16-17]。

鉴于Hr基因在毛发生长发育过程中的重要作用，为了深入了解Hr基因组成差异，作者克隆了YCHR Hr基因cDNA序列共计5 232 bp，该基因编码的Hr蛋白由1 207个氨基酸残基组成。在此基础上，作者对包括YCHR在内的8个物种的9条Hr基因的cDNA序列及其编码的Hr蛋白氨基酸序列进行了同源性分析，发现YCHR Hr基因cDNA序列同GenBank上发布的BN大鼠、小家鼠、野猪、家牛、普通猕猴、人、黑腹果蝇和桔小实蝇的同源性分别为99.8%、87.3%、67.3%、70.2%、80.8%、79.8%、29.8%和24.9%，氨基酸序列同源性分别为100.0%、92.9%、75.4%、74.8%、76.0%、77.8%、7.4%和11.7%，表明Hr基因在哺乳动物中同源性较高，具有一定的保守性，其编码蛋白可能具有相同的结构域，如锌指结构等；而与昆虫等非哺乳类动物的同源性较低，存在功能上的差异性。

近年来有报道[18]指出，某些高度保守的单分子进化系统是研究相应物种基因组水平的重要证据和线索，能够简便有效地揭示出某些基因及其编码蛋白的生物学功能。进一步分析Hr基因及其编码蛋白的同源性，可以发现Hr基因在人类与各种模式生物，如大小鼠等存在着一定的序列与功能上的异同点，利用这一特点，可以把来源于不同模式生物的Hr基因作为人类Hr基因的天然突变体来进一步研究该基因及其编码蛋白的结构和功能。

综上所述，作者克隆并获得了YCHR Hr基因cDNA的完整序列，该序列已提交给GenBank，并通过对不同物种Hr基因cDNA序列及其编码的Hr蛋白氨基酸序列的同源性比较，初步了解了Hr基因在物种进化上的同源性和保守性，为今后进行Hr基因的多态性检测及开展Hr基因与毛发生长发育和YCHR某些性状的相关性研究提供了基础性资料。

参考文献

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[18]章金涛,张明昊,王纯耀.豫医卷毛大鼠表皮生长因子受体基因的比较生物学分析[J].郑州大学学报(医学版),2011,46(3):351

(2015-04-21收稿责任编辑赵秋民)

*国家自然科学基金资助项目 31071923

Comparative biology analysis of hairless gene cDNA sequence in Yuyi curly hair rats

ZHANGMinghao1),ZHANGJintao2)

1)MedicalScienceFunctionLaboratory,SchoolofBasicMedicine,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou4500462)LaboratoryAnimalCenter,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordscurly hair rat; hairless gene; homology comparison

中图分类号Q953

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.007 [15]ZARACH JM,BEAUN GM,COULOMBE PA,et al.The co-repressor hairless has a role in epithelial cell differentiation in the skin[J].Development,2004,131(17):4189