高血压大鼠心肌组织中睾酮受体蛋白的表达*

李　渊，王　颖#，燕树勋，杨国杰，张彦周，孙丽娜，于超男，杨晓村

1)郑州大学第一附属医院老年医学科 郑州 450052　2)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 450052　3)河南中医学院第一附属医院内分泌科 郑州 450008　4)郑州大学第一附属医院心内科 郑州 450052



高血压大鼠心肌组织中睾酮受体蛋白的表达*

李渊1，2)，王颖1，2)#，燕树勋3)，杨国杰1，2)，张彦周4)，孙丽娜1，2)，于超男1，2)，杨晓村1，2)

1)郑州大学第一附属医院老年医学科 郑州 4500522)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 4500523)河南中医学院第一附属医院内分泌科 郑州 4500084)郑州大学第一附属医院心内科 郑州 450052

关键词睾酮受体；心肌重构；丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶1；大鼠

摘要目的：探讨高血压心肌重构中睾酮受体表达水平改变的意义。方法：以“两肾一夹”法制备高血压大鼠模型。实验分为3组：对照组(n=10，不给予任何处理)、假手术组(n=10)和模型组(n=10)。术后8周，HE染色观察大鼠心肌组织形态学变化，免疫组化法检测心肌组织中睾酮受体及丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶1(MKP-1)蛋白的表达。结果：与对照组和假手术组相比，模型组心肌纤维排列紊乱，部分心肌纤维断裂，心肌表现为不同程度肥大或变性，睾酮受体及MKP-1蛋白表达水平降低(P<0.05)，且二者存在线性正相关关系(r=0.657，P=0.039)。结论：睾酮受体参与了高血压心肌重构的过程，其作用机制可能与丝裂素活化蛋白激酶信号转导通路有关。

AbstractAim: To explore the role of testosterone receptor in hypertension myocardial remodeling.Methods: Thirty rats were allocated into three groups:control group，sham operation group，and model group(the rats were to establish hypertension model),with ten rats in each group.Eight weeks after operation,the morphological change in myocardial tissue was observed under light microscope, and the expression levels of testosterone receptor and MKP-1 were tested by immunohistochemistry.Results: Compared with the sham operation group and control group, the myocardial fibers of model group disarrayed with some broken,varying degrees of myocardial hypertrophy of degeneration,and the expression levels of testosterone receptor and MKP-1 in myocardial tissue decreased significantly(P<0.05),and they were positively correlated(r=0.657，P=0.039).Conclusion: The testosterone receptor might take part in myocardial remodeling which links with the MAPKs signal transduction pathway.

高血压心肌重构是多种心血管疾病发生发展过程中的独立危险因素，对其机制的研究意义重大[1]。睾酮是人体内最重要的性激素，主要通过睾酮受体发挥作用，二者之间存在着负反馈调节[2]。近几年国内关于睾酮受体在心血管系统中的作用研究较多，但对于心肌重构过程中心肌睾酮受体具体的作用机制尚无定论。丝裂素活化蛋白激酶系统(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是体内多种细胞信号传递的共同通路，可通过多种途径参与高血压心肌重构，而MAPKs磷酸酶1(MKP-1)是MAPKs灭活的重要途径[3]。该研究拟以“两肾一夹”肾性高血压大鼠为模型，观察睾酮受体及MKP-1蛋白在肾性高血压大鼠心肌重构过程中表达水平的变化，进而探讨睾酮受体在心肌重构过程中的作用。

1材料与方法

1.1实验动物、试剂及仪器28日龄Wistar雄性大鼠(0008508)30只，由郑州大学实验动物中心提供。ALC-NIBP无创尾动脉血压测定系统(上海奥尔科特生物科技有限公司)。RM-245石蜡包埋切片机(德国徕卡公司)，DNP-9082电热恒温箱(上海精宏公司)，电子天平、DP71型光学显微镜(日本OLYMPUS公司)，微波炉(中国格兰仕公司)，手术器械等。兔抗鼠睾酮受体抗体(sc-816)、鼠抗MKP-1抗体(sc-271684)、兔抗鼠IgG(sc-66931)均为圣克鲁斯生物技术公司产品， DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，其他试剂为市售。

1.2实验分组及标本采集大鼠适应性喂养1周后，随机分为3组。模型组大鼠用水合氯醛经腹腔麻醉后，仰卧位固定在动物手术台上;钝性分离左肾动脉，放置内径为0.2 mm的银夹并打结固定，关闭腹腔;术后腹腔注射青霉素3 d预防感染。假手术组操作方法同上，但不放置银夹。对照组不给予手术处理。分别于术前、术后1周、术后2周、术后3周、术后8周测大鼠尾动脉血压。术后4周平均收缩压大于120 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)或者较术前平均收缩压升高>20 mmHg，判定为肾性高血压大鼠造模成功[4]。

1.3观测指标

1.3.1左心室质量指数8周后，所有实验动物在深度麻醉下，开胸取出心脏，用冰生理盐水冲洗，滤纸拭干，称量全心湿质量及左心室湿质量(除室间隔及左心室外的其余组织)，计算左心室质量指数。

1.3.2心肌形态学观察左心室称重后，用中性甲醛固定，心肌组织石蜡包埋，常规制片，HE染色，光镜下观察。

1.3.3心肌组织中睾酮受体及MKP-1蛋白的检测烤片、微波炉抗原修复、血清封闭，一抗孵育(睾酮受体抗体和鼠抗MKP-1抗体均按1100稀释)、4 ℃过夜，二抗孵育(兔抗鼠IgG抗体)，DAB显色，中性树胶封片，显微镜下采集图片并应用光密度软件(Image-Pro Plus6.0)进行分析。

1.4统计学处理采用SPSS 17.0进行数据处理。采用重复测量数据的方差分析比较3组不同时期血压水平；3组心肌组织中睾酮受体及MKP-1蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；采用Pearson相关分析睾酮受体和MKP-1蛋白表达的相关性，检验水准α=0.05。

2结果

2.13组大鼠血压的比较模型组均造模成功。8周内，对照组和假手术组血压值无明显变化，模型组血压逐渐升高，见表1。

表1　3组大鼠不同时期的血压　mmHg

F组间=1 211.779，F时间=1 613.225,F交互=1 537.050，P均<0.001。

2.23组心肌形态学变化见图1。对照组大鼠心肌细胞完整,肌纤维排列整齐；假手术组同对照组相比无明显差异；模型组大鼠心肌纤维部分断裂,排列紊乱,心肌细胞肿胀或有核固缩、消失，心肌间结缔组织增多。

A：假手术组；B：对照组；C：模型组。图1　3组大鼠心肌形态学变化(HE,×400)

2.33组左心室质量指数的比较见表2。与假手术组和对照组相比，模型组左心室质量指数明显升高。

A：假手术组；B：对照组；C：模型组。图2　3组睾酮受体(1)及MKP-1蛋白(2)的表达(免疫组化，×400)

2.43组心肌组织中睾酮受体和MKP-1蛋白表达水平的比较见图2及表2。对照组、假手术组、模型组心肌组织中均有睾酮受体和MKP-1蛋白表达。与对照组相比，假手术组两种蛋白的表达水平无明显变化；模型组两种蛋白的表达水平较对照组和假手术组明显降低。

表2　术后8周3组左心室质量指数、

*：与对照组和假手术组相比，P<0.05。

2.5模型组大鼠心肌组织中睾酮受体蛋白与MKP-1蛋白表达的相关性分析模型组中睾酮受体蛋白与MKP-1蛋白表达水平呈正相关(r=0.657,P=0.039)。

3讨论

研究[5]证实，生理剂量的睾酮可以抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞的增殖，提示睾酮对心血管系统有保护作用，且其机制与MAPKs有关。睾酮的作用主要是通过睾酮受体实现的，睾酮受体主要分布于细胞核，既可以与进入胞内的睾酮特异性结合发挥效应，又可以通过EGRF、IGRF、G蛋白偶联途径改变胞内磷酸酶和激酶的活性，产生不依赖睾酮的作用，还可以通过与c-Jun、c-Fos、Spl和NF-kB的相互作用发挥调控功能[6]。研究[7]证实睾酮受体参与了包括动脉粥样硬化、前列腺增生、肥胖、糖尿病等多种疾病的发生发展过程。关于睾酮受体在心血管系统中的作用尚未达成共识，有研究[8-9]称通过抑制睾酮受体可以在一定程度上抑制动脉粥样硬化的发生与发展，但亦有研究[10]认为睾酮受体可以通过RAS系统对血压产生影响。

MAPKs是多种胞外信号引起细胞增殖、增生、肥大的胞内信号传递的汇聚点和共同通路,其参与高血压心肌重构的过程主要是通过P38通路、ERK通路和JNK通路[11]3种途径来实现的。MKP-1是MAPKs灭活的重要途径。高血压心肌重构不仅与MAPKs的过度激活有关，还涉及MAPKs的灭活障碍[12-14]。

作者以肾性高血压大鼠为研究对象，观察了其心肌组织中睾酮受体和MKP-1蛋白的表达情况。研究结果显示：与对照组和假手术组相比，模型组心肌组织中睾酮受体和MKP-1蛋白表达水平降低，提示二者可能参与了高血压心肌重构的过程；心肌组织中二者的表达存在线性正相关，提示睾酮受体蛋白参与高血压心肌重构的过程可能与MKP-1途径有关。

综上所述，睾酮受体和MKP-1蛋白表达水平在高血压心肌重构过程中均发生了改变，二者呈正相关，睾酮受体对高血压心肌重构的作用机制与MAPKs通路有关，二者共同作用于高血压心肌重构的发生发展过程。

参考文献

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*国家留学基金委河南省地方合作项目201308410293；河南省科技厅基础与研究项目132300410464；河南省教育厅科学技术研究重点项目基础研究计划13A320436；河南省卫生科技创新型人才工程中青年科技创新人才项目4099；河南省卫生厅及郑州大学第一附属医院共建青年创新基金项目(2009年)；河南省医学科技攻关计划项目2011020038

Expression of testosterone receptor in myocardial tissue from hypertensive rats

LIYuan1，2)，WANGYing1，2)，YANShuxun3)，YANGGuojie1，2)，ZHANGYanzhou4)，SUNLina1，2)，YUChaonan1，2)，YANGXiaocun1，2)

1)DepartmentofGeriatrics，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500522)Key-DisciplinesLaboratoryofClinical-MedicineofHenan，Zhengzhou4500523)DepartmentofEndocrinology，theFirstAffiliatedHospital，HenanCollegeofTraditionalChineseMedicine，Zhengzhou4500084)DepartmentofCardiology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

Key wordstestosterone receptor；myocardial remodeling；mitogen-activated protein kinase phosphatase 1;rat

中图分类号R543.2

通信作者#，女，1974年6月生，博士，教授，副主任医师，研究方向：心肌重构的机制及防治，E-mail：2414714561@qq.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.005