一起由副溶血性弧菌引起食源性疾病的实验室快速诊断

宋华

（成都市疾病预防控制中心，四川610041）

一起由副溶血性弧菌引起食源性疾病的实验室快速诊断

宋华

（成都市疾病预防控制中心，四川610041）

弧菌，副溶血性/分离和提纯；食物中毒/诊断；实验室技术和方法；病例报告

2014年某日中午成都市某餐厅举行婚宴，共150余人进餐。1人于晚21：00出现上腹疼痛与水样便腹泻症状。至第2天中午12：00共24人出现相同症状。经流行病学调查、临床资料和实验室诊断确认为由副溶血性弧菌引起的食源性疾病，现报道如下。

1　临床资料

采集餐厅可疑食物和环境涂抹样7份、患者肛拭大便12份。培养基按照文献［1］要求制作，采用VITEKAMS微生物系统生化鉴定卡（法国生物-梅里埃公司生产）检测。具体步骤：（1）肛拭大便进行可疑食物增菌18h同时分离培养18 h；（2）挑取可疑菌落接种于He培养基（hektoen enteric agar，He）、麦康凯琼脂培养基（mac conkey，Mac）、硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基（thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS）、含1.5%蛋白胨营养琼脂和血平板36℃培养18 h；（3）挑取乳糖阴性、氧化酶阳性、革兰阴性杆菌阳性转种三糖铁36℃培养8 h，制成菌悬液，接种于革兰阴性菌鉴定卡生化鉴定5～10 h报告结果。12份肛拭大便在He、Mac平板上培养结果为乳糖阳性、氧化酶阴性、革兰阴性杆菌阳性，6份肛拭大便在He、Mac平板上培养结果为乳糖阴性、氧化酶阳性、革兰阴性杆菌阳性。6份肛拭大便均分离出副溶血性弧菌（其中5份生化编码为6003000024，鉴定率为86.0%，1份生化编码为6003000026，鉴定率为96.0%）。7份可疑食物和环境涂抹样中从虾中分离出副溶血性弧菌（生化编码为6003000024，鉴定率为86.0%），未分离出其他肠道致病菌和致病性球菌。虾和6份患者肛拭大便均分离出副溶血性弧菌，其中5人与虾中分离的菌株生化编码一致，提示本次食源性疾病是由副溶血性弧菌所致。

2　讨论

细菌是引起食源性疾病的最主要原因。世界卫生组织报告表明，全球食源性疾病患者达数亿人，每年约有几亿腹泻病例，导致约300万5岁以下儿童死亡，其中约70.0%因为生物源性污染食品所致。在发展中国家估计每年发生腹泻及其相关疾病者2.7亿例，导致240万5岁以下儿童死亡［1］。我国国家食源性疾病监测网从1992～2001年对北京、重庆、福建等13个省、自治区、直辖市覆盖人口6.43亿（占我国人口50.8%）的监测结果表明，10年间上报食源性疾病暴发事件5 770起，患者162 995例，其中微生物引起的食源性疾病事件和涉及的人数最多，分别占总数的38.0%、50.9%，患者数约为化学物引起的2倍。考虑到症状轻未就诊或漏报等原因，我国实际食源性疾病患者数应为（20～40）万/年，而隐性感染者可能更多［2］。中国工程院院士陈君石表示，最近一项食源性疾病主动监测结果显示，我国平均6.5人中就有1人罹患食源性疾病，食源性疾病已成为我国头号食品安全问题［3］。但由于各种条件限制，细菌性食源性疾病的实验室诊断率较低。作者结合本次食源性疾病的案例，就细菌性食源性疾病的实验室诊断各阶段操作体会如下。

2.1采样阶段采样是采取物质、材料或产品的一部分，作为其整体的代表性样品进行检测的一种规范操作。在诸多技术环节中采样最具不确定性。没有有效的采样，实验室诊断就无从谈起。在实际工作中由于对食物中毒调查采样不够规范，直接影响了实验室诊断结果，对确定中毒病因造成很大的影响［4］。有效性的采样应包括样品的代表性、采样的及时性和操作的规范性。

2.1.1样品的代表性采集的样品应具有代表性，能反映食源性疾病发生时的食品卫生状况。样品采集应根据临床症状和现场流行病学调查结果，有重点、有目的地进行。采样的对象应包括可疑食物、呕吐物、粪便、血液、容器与环境涂抹样等。在食源性疾病的实验室快速诊断中，患者粪便是不可忽视的，这是因为：（1）细菌性食源性疾病患者粪便中的菌相分布相对可疑食物简单，病原菌呈一定优势生长；（2）粪便可直接培养，节省了增菌时间，通过生化鉴定往往可以比食物更早分离出病原菌；（3）不同细菌性食源性疾病临床症状往往非常相似，用流行病学手段往往难以准确界定病原菌，如果可疑食物多（如宴会等），单从可疑食物入手，实验室诊断工作量会非常大。本次食源性疾病就早于食物18 h从4份患者肛拭大便中分离出副溶血性弧菌，对后来的可疑食物的病原菌分离具有一定指导意义。此外对采用传统方法的实验室，同时还应尽量采集患者急性期及恢复期的双份血清，观察其效价是否增高，为确诊病原菌提供可靠依据。

2.1.2采样的及时性在食源性疾病调查中样品采集往往由其可获性所决定。因此，能否对食源性疾病进行准确的实验室诊断，很大程度上取决于采样的及时性。马莺华［5］对平湖市1993～2003年细菌性食源性疾病进行统计发现，采样时间与病原菌检出率密切相关。发病后24 h内采集病原菌检出率为93.1%，发病后24 h以上采样检出率仅为8.3%。接到食源性疾病报告后应尽快赶到现场及时采样，避免患者大剂量注射或服用抗生素及可疑食物和现场被人为破坏。

2.1.3操作的规范性样品的采集、包装、标识、运送、保留与记录应按照相关规范执行。采样过程中对影响检测结果的各种因素要严格控制，尤其是对无菌操作、样品包装、运送条件与时间的控制。如果患者已服用抗生素，应了解抗生素的种类、剂量和服用时间，并告之实验室，以便实验室对样品采取对应措施。在食源性疾病调查中，采样记录是最重要的证据之一。因此，采样记录应清晰明了，并在工作现场予以记录。记录的内容包括采样依据、采样人的识别、环境条件（如果相关）、必要的操作步骤、采样位置、统计方法、样品包装、数量及状态描述等。

2.2实验室诊断阶段

2.2.1培养基的选择培养基的作用是利用细菌的繁殖特性筛选出可疑菌。因此，培养基的选择是影响检测结果准确性和检出率高低的重要因素。对食源性疾病的检测应本着“多种思路、多种方法、同时选择多种细菌”的原则，注意培养基选择性的强弱搭配，即要避免致病菌的漏检，还要避免因盲目接种增大检验工作量。作者认为，在流行病学调查基础上接种亚西酸盐胱氨酸增菌液、革兰阴性杆菌增菌液、7.5%氯化钠肉汤、1%葡萄糖肉汤、氯化钠结晶紫增菌液、碱胨水即可满足常规食源性疾病检测的需要。对样品的分离也宜采用弱选择性平板，这是因为：（1）弱选择性平板抑菌性弱，可尽量保留直接培养物的菌相分布特征，微生物恢复与生长较快，其指示系统还可帮助筛选可疑菌，缩短鉴定前的准备工作。（2）强选择性平板抑菌性强，往往掩盖优势菌下的被抑制菌，造成分离不纯，常致使生化结果混乱。本次食源性疾病采用血平板、含1.5%蛋白胨营养琼脂（增加含蛋白胨量可促进细菌快速生长）、He、Mac和TCBS平板。这些平板具有溶血、蔗糖、乳糖和硫化氢指示系统，对筛选可疑菌十分方便。在分离培养（菌落分布调查除外）时也未拘泥于国家标准规定的时间，一旦平板形成明显菌落即可进行下一步生化鉴定，如弧菌科细菌往往7～8 h即在平板上形成单个明显菌落，而不必等待18～24 h。

2.2.2病原菌的鉴定生化反应依然是最常用的病原菌鉴定手段。随着计算机的应用，生化反应已广泛采用生化鉴定系统。与常规生化的双歧索引法比较，生化鉴定系统采用数码法，通过计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和，可将某一细菌的全部生化反应结果快速转录成数字（编码）而得出细菌名称，具有快速、准确和节约时间、空间、人力、物力等优点，是微生物快速鉴定的一个发展方向。本次食源性疾病采用VITEK-AMS自动生化鉴定系统，配套7种鉴定卡。工作模式：纯菌+合适鉴定卡=结果。菌落分纯后仅需通过革兰染色、氧化酶、触酶等实验选择鉴定卡种类，然后进行菌液接种、孵育、判断、结果打印均由仪器自动完成，实现生化鉴定的快速化。本次实验室检查应用该系统在10 h内完成可疑菌的生化鉴定，其中对第一株副溶血性弧菌的鉴定仅用了5 h。当病原菌难以被分离（如发病早期服用抗生素，样品中的病原菌受抑制或被杀死）时，有条件的实验室还可采取其他手段。基于基因分析的聚合酶链反应（pdymerase chain reaction，PCR）、基因探针杂交技术，基于免疫技术的免疫荧光、免疫酶、胶体金检测等对病原菌鉴定的报道亦多见于文献。特别是病原微生物PCR快速检测技术，已应用于我国的食源性疾病监控体系。

2.2.3同源性分析病原菌的确定应有可靠的证据。并非在某个样本中分离到某种细菌就可以定性，在多个样本中分离到同一细菌时还要符合“同源性”，证据才会完整。血清学试验是测定抗体水平，诊断细菌性食源性疾病的经典方法，但实验周期长（1～3周）。在实际工作中，人员容易失访，采血特别是恢复期采血容易受到拒绝。本次食源性疾病中1份患者粪便和虾中分离的副溶血性弧菌在生化上存在一定差异，由于缺少血清学试验，使得诊断依据不完整。随着技术的进步，以核酸分析为代表的分子生物学技术作为细菌同源性分析的手段已经成熟，试验周期1～3 d，结果更准确、可靠。其中DNA指纹图谱分型技术已作为食品安全关键技术用于我国食源性疾病监控体系。将分子生物学诊断手段与常规分离鉴定方法有机结合，是今后公共卫生事件实验室调查的一个有力手段［6］。

2.3食源性致病菌监测系统要增强对食源性疾病暴发的反应和预警能力还需建立和完善食源性疾病监测和预警系统，以明确食物链中食源性致病菌的相关食品及其污染的关键环节。2000年中国疾病预防控制中心建立了全国食品污染物监测体系，构建了国家级监控网络和数据库，应用了微生物危险性评估技术、DNA指纹图谱分型技术、病原微生物PCR快速检测技术等，为食源性疾病监控提供了一个技术平台。今后还应继续加强和完善该网络的建设，不断提高食源性致病菌实验室检测能力，为食源性疾病的诊断提供技术支持。

［1］中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 4789.28-2013食品安全国家标准：食品微生物学检验：培养基和试剂的质量要求［M］.中国标准出版社，2014.

［2］刘秀梅，陈艳，王晓英，等.1992～2001年食源性疾病暴发资料分析——国家食源性疾病监测网［J］.卫生研究，2004，3（6）：725-727.

［3］谢晓东，宋伟民.沙门菌属性食物中毒及其预防［J］.上海预防医学杂志，2003，15（1）：7-8.

［4］陈君石.食源性疾病是我国头号食品安全问题［J］.科学中国人，2012（10）：71.

［5］马莺华.平湖市1993-2003年细菌性食物中毒原因分析［J］.浙江预防医学，2004，16（7）：38.

［6］陈秀香，李羡亭，王爱新.细菌性食物中毒调查采样对实验室诊断的重要性［J］.中国城乡企业卫生，2011，26（6）：99.

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.12.073

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1009-5519（2016）12-1951-02

（2016-01-18）