人类乳头状瘤病毒与头颈部肿瘤放疗的关系

冷林蔓综述，陈晓品审校

（重庆医科大学，重庆400016）

人类乳头状瘤病毒与头颈部肿瘤放疗的关系

冷林蔓1综述，陈晓品2△审校

（重庆医科大学，重庆400016）

乳头状瘤病毒科；头颈部肿瘤/放射疗法；辐射耐受性；综述

随着近年来对头颈部鳞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC），尤其是口咽鳞癌（oropharyngeal squamous cell carcinoma，OPSCC）发病机制的不断研究发现，人类乳头状瘤病毒（human papilloma virus，HPV）阳性HNSCC患者在生存率及病死率方面明显优于HPV阴性者（多因吸烟等传统因素所致）［1］。有研究表明，这与HPV阳性患者吸烟率低，从而减少吸烟带来的相关合并疾病及继发的头颈部恶性肿瘤而致死的可能有关［2］。HPV阳性是提示HNSCC预后良好的指标，这与HPV阳性HNSCC细胞的放疗敏感性增加有关，但该类研究尚存在局限性。而如何增加放疗敏感性、提高放疗疗效是目前HNSCC放疗的热门话题［3］。本文主要介绍国外目前关于HPV阳性HNSCC放疗敏感性是否增加及其生物学机制的研究，以期为临床治疗提供更多的论据支持。

1　HPV感染状态

已有大量临床试验针对HPV阳性、阴性HNSCC对放疗反应性问题展开研究。从目前收集的数据看，该问题尚存在争议，一些数据显示，肿瘤细胞对放疗的敏感性增强，而有的则表明，放疗敏感性会减弱，甚至无效。Kimple等［4］随访了HPV阳性、阴性HNSCC患者同时给予2 Gy照射后的平均存活分数，HPV阳性患者存活分数（22.0%）低于HPV阴性者（59.0%），差异有统计学意义（P=0.000 1），表明HPV阳性患者癌细胞对放疗敏感性没有增加。Spanos等［5］利用克隆存活实验评价逐渐递加放射剂量后HPV阳性、阴性HNSCC细胞系发现，与HPV阴性细胞系比较，HPV阳性细胞系随放射剂量递增放疗抵抗性增强；该研究又采用梯度放射剂量对HPV阳性、阴性小鼠扁桃体上皮细胞（MTEC）进行观察，HPV阳性MTEC体外存活率高于HPV阴性细胞，从侧面证明了上述在人体细胞系中的结论。而Nagel等［6］对4种HPV阳性细胞和14种HPV阴性细胞的放疗敏感性进行了比较发现，HPV感染对各细胞的放疗反应性并无显著影响。

关于上述这些差异，可从以下几个方面进行解释：（1）各研究本身存在方法偏倚，且缺乏公认的比较标准，致使得出的研究结果不一致；（2）肿瘤细胞中是否存在HPV感染未明确提及检测方法，只有个别研究提供了在HNSCC患者中检测到HPV DNA和E6/E7 mRNA存在的证据；（3）一些研究提到HPV阳性、阴性HNSCC细胞的放疗敏感性范围较大，导致细胞的生存率存在交叉重叠。放疗敏感性差的HPV阳性细胞与放疗敏感性最强的HPV阴性细胞之间的这种交叉重叠或许可在一定程度上解释结果的矛盾性。

2　HPV阳性HNSCC放疗敏感性增加的生物学机制

2.1DNA的自我修复能力电离辐射（ionizing radiation，IR）主要是通过损伤肿瘤细胞DNA，导致基因组双链断裂（double-strand breaks，DSB）、诱导细胞凋亡而发挥生物学效应。而IR导致细胞死亡又主要通过p53介导产生。尽管体内p53受HPV E6癌蛋白的作用部分失活，但与HPV阴性肿瘤比较，HPV阳性肿瘤仍可表达较低活性的野生型p53。Kimple等［4］认为，放疗后TP53诱导细胞凋亡的增多在增强HPV阳性OPSCC放疗敏感性方面发挥了关键作用。该研究通过caspase活性测定及流式细胞术检测细胞膜的改变对细胞凋亡进行了评估。结果发现，单次4 Gy剂量照射后HPV阴性细胞caspase活性未增加，而HPV阳性细胞caspase活性增加了85.0%，二者比较，差异有统计学意义（P=0.002 0）。HPV阳性细胞凋亡显著增加可通过流式细胞术得以确定。此外Kimple等［4］还在放疗后24 h使用全基因组基因芯片对HPV阳性、阴性细胞基因表达进行了比较，结果提示，HPV阳性细胞p53通路的多种基因发生上调。因此可认为，尽管HPV E6癌蛋白可下调p53，但残余的野生型p53仍可在放疗后诱导细胞凋亡。Rieckmann等［7］认为，损伤DNA的修复能力是HPV阳性细胞对IR反应性增强的原因。其用抗c-H2AX和抗53BP1抗体（细胞对DSB反应的早期信号）进行免疫荧光染色发现，HPV阳性组放疗后DSB较HPV阴性组多，而未修复的DSB可通过细胞有丝分裂障碍导致细胞死亡，从而认为，HPV阳性HNSCC细胞中残余DSB与细胞放疗敏感性呈正相关。但关于改变DNA修复能力的潜在机制仍有待于进一步研究。而Applebaum等［8］认为，XRCC1（一种与DSB修复有关的主要蛋白）与HPV相关的HNSCC并无关。Moon等［9］在人体HPV阳性头颈部癌细胞中发现，E7癌蛋白减少了DNA损伤的修复，故认为HPV E7癌蛋白在DNA修复方面具有直接或间接作用。Dok等［10］的研究则很有意思，其提到了HPV介导的OPSCC中的一项特征，即p16高表达可破坏RAD51向DNA损伤部位聚集，从而减少同源重组介导的DNA修复途径；p16对放疗敏感性的影响不是通过p16对CDK4/6的抑制，而是由p16的其他功能所诱导。事实上，p16可通过下调cyclinD1抑制RAD51向DNA损伤部位聚集。而RAD51又是同源重组介导的DNA修复途径所必需的因子。因此，Dok等［10］指出，p16过表达可导致非同源末端连接途径（non homologous end joining pathway，NHEJ）增加，从而引起DNA DSB错修复。为支持该假设，其还与p16阴性细胞进行了比较，结果发现，p16阳性细胞在放疗后微小有核细胞的频率增加，这也是NHEJ错修复的一项特征。该发现如果得到证实，或许可部分说明p16高表达对OPSCC预后的积极影响，且这种积极影响并不受HPV感染状态的影响。尽管相关文献较为有限，且观点上存在冲突，但上述研究表明，即使是在非口咽部癌中HPV阳性/p16阳性癌的预后优于HPV阴性/ p16阴性癌。

2.2细胞再增殖-信号通路的激活表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）通路是HNSCC最常发生上调的信号通路，与治疗抵抗性和不良预后相关。有研究证实，OPSCC患者HPV感染与EGFR表达呈负相关，即在OPSCC中EGFR较少表达［11］。Gupta等［12］对3种细胞系（2种为HPV阳性，1种为HPV阴性）进行了研究，结果发现，HPV阴性细胞系放疗抵抗性最强，其中EGFR高表达。此外EGFR通过蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）活化信号传导激活，可能会激活mTOR癌基因。另外该研究还发现2种HPV阳性、EGFR阴性HNSCC细胞中PTEN状态不同，Akt表达水平存在差异。与HPV阴性HNSCC比较，PTEN表达在HPV阳性扁桃体癌中更为常见。通过利用新一代测序技术对252个HNSCC样本进行分析发现，HPV阳性肿瘤中发生遗传改变的最常见基因为PIK3CA和PTEN（通过HPV DNA测序证实）［13］。当然遗传改变也存在于HPV阴性患者中，在吸烟患者中甚至更为常见。Seiwert等［14］对120对肿瘤/健康样本（42.5%HPV阳性）中的617种癌症相关基因进行了平行测序，在HPV阴性HNSCC样本中发现大量TP53、CDKN2A、MLL2、CUL3、NSD1、PIK3CA和NOTCH基因突变。其他特殊突变（DDX3X、FGFR2/3）和畸变（KRAS、MLL2/3和NOTCH1）在HPV阳性肿瘤中较为常见。Sewell等［15］收集了29份HPV阳性和13份HPV阴性OPSCC样本并用反相蛋白芯片分析发现，HPV阳性肿瘤中所有PIK3CA激活突变，但其活化Akt及Akt靶点磷酸化平均水平均较低。此外HPVE6/E7癌蛋白过表达也同时抑制了HPV阴性细胞中Akt磷酸化。HPV阳性肿瘤中再增殖信号通路的减少或许可解释放疗敏感性的增强。

2.3细胞周期调控机制目前一致认为，细胞有丝分裂对IR尤为敏感，而处于S期晚期细胞的抗性最强。在IR诱导的DNA损伤发生后Chk1/2激酶家族被激活，通过ATM和ATR阻滞细胞周期，并修复DNA［16］。在感染HPV细胞中E6和E7分别使p53和pRb下调。正常情况下为评估DNA损伤，p53和pRb通过点激酶使细胞周期阻滞在G1/G2期，并在细胞进入有丝分裂期（M期）前修复DNA损伤。细胞应激反应机制诱导p16INK4a表达增多，并通过CDK4/6-cyclinD1-pRb通路使细胞周期阻滞。但在HPV导致的肿瘤中E7可同时灭活pRb，妨碍p16INK4a介导的细胞周期阻滞［17］。如没有这些调控机制放射线诱导的DNA损伤将不断累积，从而因有丝分裂障碍而导致细胞死亡。Arenz等［18］对4种HPV阳性和4种HPV阴性细胞系的细胞周期再分配比较发现，放疗后HPV阳性细胞通过S期在G2/M期聚集、阻滞。Kimple等［4］也发现，HPV阳性细胞存在广泛G期阻滞。磷酸ATM和磷酸ATR在HPV阳性细胞中并未发生修饰，但细胞周期检测点激酶Chk1在照射后的作用得到证实［19］。在通过逆转录病毒转染HPV16 E6/E7癌基因的骨髓源性间充质干细胞中，照射后的细胞Chk1和Chk2磷酸化水平均高于未照射细胞，但只有Chk1可消除对细胞系产生放射增敏作用［20］。选择性抑制剂——PF-00477736可消除与放射增敏同时发生由放射诱导的G2期阻滞［21］。尽管Chk1抑制的作用取决于p53状态，一项近期研究表明，使用选择性Chk1抑制剂——Chir-124抑制Chk1所产生的增敏作用与p53（-/-）和缺乏p53的野生型肿瘤细胞较为相似［22］。Chk1和（或）Chk2抑制在HPV阳性HNSCC中对野生型p53水平下降的作用仍需进一步研究。

3　肿瘤微环境的影响

3.1组织乏氧乏氧是包括HNSCC在内的局部晚期实体瘤的一项常见特征。事实上，大多数实体肿瘤中新形成的微血管存在一系列严重结构和功能异常，可破坏有效组织氧合，促进肿瘤对放疗产生抵抗性。在DAHANCA5试验的一项回顾性分析中Lassen等［23］回答了HPV阳性肿瘤放疗敏感性的增强是否是因为肿瘤细胞氧合能力较好所导致这一问题。该研究采用测定p16蛋白表达作为确定HPV感染状态的指标（p16阳性则视为HPV阳性）。结果显示，尼莫拉唑（一种缺氧细胞放射增敏剂）治疗组175例患者在局部控制方面显著优于安慰剂组156例患者（风险比为0.70，95%可信区间：0.52～0.93）。但这种改善仅在p16阴性肿瘤中具有统计学意义（P＜0.05）。由于采用替代指标确定HPV感染状态，且p16阳性OPSCC亚组的病例数和发生事件有限，所以需对结果进行谨慎的判断。这也可能是这些患者在放疗后预后良好的原因之一。为支持该假设，其进一步对252例患者血浆骨桥蛋白（一种缺氧标志物）水平和p16状态进行了相关性研究，结果显示，p16阴性肿瘤患者出现高水平血浆骨桥蛋白的可能性［41.1%（78/190）］显著高于p16阳性肿瘤患者［16.1%（10/62）］，差异有统计学意义（P=0.0001），因此，其缺氧程度也较高。但许多其他研究结果显示，HPV阳性、阴性肿瘤在缺氧程度方面比较，差异并无统计学意义（P＞0.05）。Mortensen等［24］进行的一项前瞻性研究用缺氧特异性示踪剂——F-硝基咪唑呋喃糖苷对40例接受放疗的HNSCC患者进行正电子发射断层扫描/CT检查发现，HPV感染状态与缺氧无关，因为缺氧在HPV阳性［75.0%（12/16）］、阴性［54.2%（13/ 24）］肿瘤中的分布比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。Toustrup等［25］根据肿瘤缺氧基因表达特征将323例HNSCC患者分为严重缺氧组和轻度缺氧组，其中包括84例p16阳性患者，结果显示，p16阳性、阴性患者中缺氧的出现频率相同。Kong等［26］研究了99例HNSCC患者中HPV与肿瘤氧合的相关性，其中包括33例HPV阳性OPSCC患者，结果显示，无论采用氧分压测定，还是对缺氧诱导蛋白碳酸酐酶-Ⅸ进行免疫组织化学染色，HPV感染状态与肿瘤缺氧程度均无关。尽管目前并无标准的且经过验证的缺氧生物标志物，但上述研究具有较高的一致性，肿瘤氧合可能并不是HPV阳性OPSCC对放疗反应性强的原因。

3.2抗肿瘤免疫反应越来越多的证据表明，放疗可利用宿主免疫系统间接消灭肿瘤细胞，该过程称为免疫原性细胞死亡，由死亡的肿瘤细胞发出信号，触发免疫反应［27］。因此，HPV阳性OPSCC的放疗敏感性较高至少在部分程度上可能是由放疗后免疫反应增强所致。HPV导致的OPSCC可诱导适应性免疫，作用于肿瘤细胞的病毒抗原。事实上，这些肿瘤中的免疫反应相关基因高表达（尤其是与CD8+T淋巴细胞效应功能相关的基因），且肿瘤中浸润的T淋巴细胞数量显著多于HPV阴性肿瘤［28］。这些肿瘤浸润淋巴细胞对HPV癌蛋白具有反应性，这些细胞在治疗前样本评估中如果数量较多则对良好的临床结局具有预测价值［29］。其可在肿瘤清除中发挥积极作用。然而，尽管存在抗肿瘤免疫反应，大部分HPV导致的OPSCC仍能持续存在并发生进展，提示可能存在一定的耐受或免疫逃逸机制。放疗及其产生的生理学影响可能使由免疫耐受向杀灭肿瘤方向转变，并促进已有的免疫反应。Spanos等［5］利用小鼠模型进行的体内研究结果显示，与HPV阴性肿瘤比较，具有免疫能力的HPV阳性肿瘤小鼠对放疗敏感性较强，20 Gy剂量照射可实现完全清除，而HPV阴性肿瘤则对放疗反应性差。但动物模型体内研究并不足以解释人体免疫系统对这些肿瘤的影响。为进一步探究潜在的机制，Andersen等［30］通过放疗诱导肿瘤细胞损伤和炎症，导致肿瘤抗原及危险相关分子模式分子，如高迁移率族蛋白1（high mobility group protein 1，HMGB1）释放。HMGB1可通过Toll样受体4诱导树突细胞的募集和成熟。因为病毒蛋白为外来物质，拥有较高的免疫原性，一旦进入机体，活化的树突细胞就摄取包括HPV蛋白在内的肿瘤抗原，从而刺激初始T淋巴细胞的产生，诱导非常有效的抗肿瘤免疫反应。

综上所述，HPV阳性OPSCC的放疗敏感性更高。可能均与受损DNA的自我修复能力和射线诱发的细胞免疫反应、肿瘤乏氧等有关。根据所提及的相关机制，可为未来临床治疗研究提供新方向。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2016.12.023

A

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（2016-01-30）