利用CRISPR-Cas9系统定点突变猪MSTN基因的研究

张冬杰，刘　娣，张　旭，汪　亮，杨国伟

(黑龙江省农业科学院畜牧研究所，哈尔滨 150086)



利用CRISPR-Cas9系统定点突变猪MSTN基因的研究

张冬杰，刘娣*，张旭，汪亮，杨国伟

(黑龙江省农业科学院畜牧研究所，哈尔滨 150086)

摘要：为了今后能够有效的利用CRISPR-Cas9系统进行基因功能研究及转基因动物的培育，本研究将带有绿色荧光蛋白(GFP)和肌肉生长抑制素基因(Myostatin，MSTN)靶序列的CRISPR-Cas9系统转染入PK15细胞系，利用流式细胞仪分离并收集转染成功的阳性细胞，使用PCR扩增结合克隆测序的方法检测和分析CRISPR-Cas9系统的定点突变情况，以评价CRISPR-Cas9系统的作用效果。结果发现，随机挑选的100个阳性克隆中，38个发生了变异，突变效率为38%，其中32个为插入突变，6个为缺失突变。插入突变中突变1(Mutation1)所占比例最高，为47.4%。本研究中CRISPR-Cas9系统的突变效率达到了38%，是目前进行基因组编辑的一个有效工具，推测其突变类型具有一定的偏好性。

关键词：CRISPR-Cas9系统；基因组编辑；突变率

CRISPR-Cas9系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是目前被广泛关注的一种基因编辑系统。与锌指核酸内切酶(Zinc finger endonuclease，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)等打靶技术相比，CRISPR-Cas9系统的准确性更高，成本低，易操作，无物种限制，使用上更安全。

1987年Y.Ishino等首次报道了在大肠杆菌中发现的CRISPR序列，但功能未知[1]。随后，科学家们在多种细菌和古细菌中发现了这种串联重复结构，并在2002年由R.Jansen将其正式命名为CRISPR[2]。2011年E.Deltcheva等发现了一种新的与CRISPR-Cas9系统相关的RNA，即tracrRNA(Trans-activating RNA)[3]。随后，与E.Deltcheva同实验室的M.Jinek发现并证实了Cas9是与两种RNA(crRNAs和tracrRNA)一起行使功能的一种核酸内切酶[4]。CRISPR-Cas9的结构及作用机理基本清楚。2013年1月同时报道了2篇成功利用CRISPR-Cas系统进行基因定向修饰的研究结果[5-6]。开启了利用CRISPR-Cas9系统编辑基因组的时代。随后，多个研究小组实现了利用该系统同时对两个基因、甚至更多个基因进行定向修饰的研究[7-8]。研究对象也从最初的人类细胞、斑马鱼、小鼠等扩展到猪、食蟹猴、植物等[9]。据不完全统计，截止到2015年2月，在PubMed数据库中，与CRISPR-Cas9相关的论文报道达359篇。

该系统具有检测遗传编码内特定核苷酸顺序以及在特定位置切割DNA的能力，在这一过程中，Cas9蛋白起剪刀的作用，RNA小片段起识别的作用，确保切割发生在正确的位置。但只要存在片段识别问题，就不可避免的会发生因片段相似而出现错配的情况，因此，CRISPR-Cas9系统同样存在着与其他基因编辑系统相似的问题，即“脱靶效应”。除了小RNA错误识别靶序列造成脱靶效应外，在CRISPR系统中使用的关键酶的类型也与脱靶效应存在显著相关[10]。脱靶效应的存在会造成研究结果的不确定性以及研究工作的大量增加，会限制该系统的广泛应用。

本研究利用CRISPR-Cas9系统，定向突变猪的Myostatin基因；利用流式细胞仪分离和筛选阳性细胞；结合序列测定的方法分析突变位点、计算打靶效率，为今后利用该系统进行基因编辑提供借鉴。

1材料与方法

1.1试验材料

参照NCBI数据库中猪Myostatin基因mRNA序列(GenBank登录号：NM_214435)设计打靶位点，依据靶位点筛选原则，最终确定第3外显子处的“TTCCAGGCGAAGTTTACTGAGG”序列为靶序列，pCMV-Cas9-GFP-MSTN质粒定制于Sigma公司，质粒模式图见图1。

1.2PK15细胞的体外培养

从液氮中取出冻存的猪PK15细胞，迅速投入37～40 ℃水浴中不断摇晃使其快速溶解。低温1 000 r·min-1离心5 min，去掉上清，向细胞沉淀内加入适量的含10%胎牛血清的DMEM完全培养液，缓慢吹打混匀后，将细胞悬液移入培养皿中，再补足培养液，将培养皿置于37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养，观察细胞生长状态。待细胞汇合度达80%～90%左右时，倒掉原培养液，用无菌的D-PBS清洗细胞两次，加入适量0.25%的含EDTA的胰蛋白酶消化液，37 ℃消化细胞，在显微镜下观察细胞的形态变化，当细胞之间不再连接成片而是变圆时加入胎牛血清终止消化，轻轻吹散细胞成单细胞悬液，低温1 000 r·min-1离心5 min。弃上清，用10%胎牛血清的新鲜培养液将细胞沉淀重悬成单细胞悬液，在培养皿内补全培养液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。经过2～3次的细胞传代后，待细胞生长旺盛，状态良好时进行转染。

1.3瞬时转染

转染前1 d接种猪PK15细胞于24孔板中，待细胞汇合到80%～90%时，准备转染。转染前将培养的细胞用DMEM(无血清)清洗两遍，再换上新的无血清的DMEM。按摩尔浓度比为1︰100将质粒用无血清的DMEM-高糖培养基稀释并混匀。将Entranster用无血清的DMEM-高糖培养基稀释，室温孵育10 min后，加入到质粒稀释液中，室温孵育20 min。将细胞用无菌的PBS清洗1次，每孔加入0.5 mL无血清的DMEM-高糖培养基，然后将转染复合物滴入，轻轻摇晃混匀，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中温育4 h。温育结束后，加入500 μL无双抗的全培养基，37 ℃、5% CO2细胞培养箱中温育24 h，对转染后的细胞进行阳性细胞筛选。上述试验重复3次。

1.4流式细胞仪分选GFP阳性细胞

使用BD公司(美国)生产的FACS AiralⅡ流式分选仪，采用荧光激活细胞分类技术(FACS)分选收集GFP+和GFP-的PK15细胞，以未转染pCMV-Cas9-GFP-MSTN质粒的PK15细胞作为阴性对照，分选结束后抽提GFP+细胞的DNA。上述试验重复3次。

1.5阳性细胞的克隆测序

将收集到的阳性细胞按照常规的酚-氯仿提取方法提取总DNA。用紫外分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳检测质量。在靶位点两侧设计1对引物，引物序列为F：5′-CGTTTCCGTCGTAGCGTGAT-3′，R：5′-TGAATGAGAACAGCGAGCAA-3′。PCR扩增目的片段后，回收纯化目的片段，连入pMD18-T载体，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆菌落100个，LB液体培养基活化后，送交库美公司测序。上述试验重复3次。

1.6数据分析

使用MEGA6.0软件对所测得的序列进行比对，尤其关注靶位点区间序列的变异情况，统计变异类型，计算突变比例。

2结果

2.1流式细胞仪分选GFP阳性细胞

转染了pCMV-Cas9-GFP-MSTN质粒的PK15细胞，经流式细胞仪分选后，GFP阳性细胞得率为12.6%，分离后获得的GFP阳性细胞纯度为81.5%。阴性对照组细胞的GFP阳性细胞得率为0。具体试验结果见图2。

2.2定点突变分析

使用MEGA6.0软件对测得的序列进行比对，重点关注定点突变位置“TTCCAGGCGAAGTTTACTGAGG”处的碱基变异情况。共检测到11种突变类型，其中插入突变5种，缺失突变6种。插入突变多发生在第16和第17位碱基之间A/C处，6种缺失突变中仅有一个发生了大片段的缺失，即靶序列两侧也发生了碱基的缺失，插入突变结果见图3，缺失突变结果见图4。

2.3突变效率的统计分析

每次试验均挑取100个阳性克隆测序，以3次重复数据的均值计算突变效率。3次重复试验的平均突变率为38%，11种突变类型占总突变数的比例见表1。

表111种突变类型个体数占总突变数的比例

Table 1The ratio of individuals with 11 mutation types to total mutation number

3讨论

CRISPR-Cas9系统是最新发现的一种基因组编辑技术，是由细菌和古细菌中存在的Ⅱ型CRISPR/Cas获得性免疫系统经人工改造而成。该系统的作用原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(Trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。通过人工设计这两种RNA，改造成具有引导作用的sgRNA(Short guide RNA)，以引导Cas9对DNA的定点切割。因此，在最早利用该系统进行基因组编辑的研究中，tracrRNA/crRNA复合物和Cas9蛋白是作为两个独立的单元发挥作用。后来，科学家们发现，作为一种RNA导向的双链DNA结合蛋白，Cas9核酸酶是目前已知的第一个统一因子，能够共定位RNA、DNA和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的Cas9融合，并表达适当的sgRNA，可靶定任何双链DNA序列，而RNA可链接到sgRNA的末端，不影响Cas9的结合，因此，Cas9能在任何双链DNA序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力[11]。本研究中所用到的pCMV-Cas9-GFP-MSTN质粒，即采用了将gRNA和Cas9构建于同一个质粒上的策略。同时该质粒还插入了绿色荧光蛋白(GFP)基因，可在细胞水平上检测转染效率。

针对哺乳动物细胞的研究表明，sgRNAs和基因组DNA之间错配碱基的数量、位置和分布是影响脱靶效率和突变效率的一个主要因素。为了减少脱靶效率，sgRNA的总体设计原理即是将sgRNAs的错配率降至3个或3个以下。但是也有研究表明，sgRNAs的20个碱基中，只有靠近PAM(Protospacer-adjacent motif)处的5～12 bp碱基是“核心序列”，显著影响突变效率，而位于PAM末端核酸的错配对突变效率的影响要远远小于“核心序列”。此外，CRISPR/Cas9对靶基因的识别是通过RNA与DNA的结合，二者结合的牢固性也是容易造成脱靶的另一个原因[12]。

本研究中所获得的MSTN基因38%的突变效率高于利用该系统突变羊MSTN基因的效率(19.3%)[13]，但显著低于在大鼠胚胎中单敲除Tet-3基因的效率(100%)[14]。在人类293T细胞中突变AAVS1的效率为10%～25%，在K562细胞中突变该基因的效率为8%～13%[15]。在果蝇胚胎中突变yellow gene的最高效率为88%，white gene的最高效率为25%[16]。已有的研究结果表明，不同物种、不同细胞系、不同基因的敲除效率不尽相同，这说明CRISPR-Cas9系统的突变效率除了受到自身结构的影响，还受到许多其他因素的影响。

参考文献(References)：

[1]ISHINO Y，SHINAGAWA H，MAKINO K，et al.Nucleotide sequence of theiapgene，responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion inEscherichiacoli，and identification of the gene product[J].JBacteriol，1987，169(12)：5429-5433.

[2]JANSEN R，EMBDEN J D，GAASTRA W，et al.Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J].MolMicrobiol，2002，43(6)：1565-1575.

[3]DELTCHEVA E，CHYLINSKI K，SHARMA C M，et al.CRISPR RNA maturation bytrans-encoded small RNA and host factor RNase III[J].Nature，2011，471(7340)：602-607.

[4]JINEK M，CHYLINSKI K，FONFARA I，et al.A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J].Science，2012，337(6096)：816-821.

[5]JIANG W，BIKARD D，COX D，et al.RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems[J].NatBiotechnol，2013，31(3)：233-239.

[6]HWANG W Y，FU Y，REYON D，et al.Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system[J].NatBiotechnol，2013，31(3)：227-229.

[7]CONG L，RAN F A，COX D，et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J].Science，2013，339(6121)：819-823.

[8]WANG H，YANG H，SHIVALILA C S，et al.One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering[J].Cell，2013，153(4)：910-918.

[9]刘志国.CRISPR/Cas9系统介导基因组编辑的研究进展[J].畜牧兽医学报，2014，45(10)：1567-1583.

LIU Z G.Research progress on CRISPR/Cas9 mediated genome editing[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2014，45(10)：1567-1583.(in Chinese)

[10]KUSCU C，ARSLAN S，SINGH R，et al.Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease[J].NatBiotechnol，2014，37(7)：677-683.

[11]MALI P，ESVELT K M，CHURCH G M.Cas9 as a versatile tool for engineering biology[J].NatMethods，2013，10(10)：957-963.

[12]REN X，YANG Z，XU J，et al.Enhanced specificity and efficiency of the CRISPR/Cas9 system with optimized sgRNA parameters in Drosophila[J].CellRep，2014，9(3)：1151-1162.

[13]HAN H B，MA Y H，WANG T，et al.One-step generation of myostatin gene knockout sheep via the CRISPR/Cas9 system[J].FrontAgrSciEng，2014，1(1)：2-5.

[14]LI W，TENG F，LI T，et al.Simultaneous generation and germline transmission of multiple gene mutations in rat using CRISPR-Cas systems[J].NatBiotechnol，2013，31(8)：684-686.

[15]MALI P，YANG L，ESVELT K M，et al.RNA-guided human genome engineering via Cas9[J].Science，2013，339(6121)：823-826.

[16]BASSETT A R，TIBBIT C，PONTING C P，et al.Highly efficient targeted mutagenesis of drosophila with the CRISPR/Cas 9 system[J].CellRep，2013，4(1)：220-228.

(编辑郭云雁)

Study of PigMSTNGene Point Mutation Based on the CRISPR-Cas9 System

ZHANG Dong-jie，LIU Di*，ZHANG Xu，WANG Liang，YANG Guo-wei

(InstituteofAnimalHusbandry，HeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences，Harbin150086，China)

Key words:CRISPR-Cas9 system；genome editing；mutation rate

Abstract:In order to more effectively apply CRISPR-Cas9 in researches on gene functions and transgenetic animals，we transfected the PK15 cell line with the CRISPR-Cas9 system containing GFP andMyostatin.Positive cells were separated and collected by flow cytometry.Point mutations were detected and analyzed by PCR and DNA sequencing.The results showed that，among 100 randomly-selected positive clones，the mutation rate was 38%，including 32 insertions and 6 deletions.Mutant 1(one of the insertions) had the highest frequency(47.4%).In this experiment，the mutation rate of CRISPR-Cas9 system is 38% and certain mutation type bias is observed.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.028

收稿日期：2015-01-07

基金项目：哈尔滨市科技局项目(2013RFQYJ037)

作者简介：张冬杰(1980-)，女，黑龙江桦南人，副研究员，博士，主要从事猪分子遗传学研究，Tel：0451-87502330，E-mail：djzhang8109@163.com *通信作者：刘娣，教授，E-mail：liudi1963@163.com

中图分类号：S828；S813.3

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)01-0207-06