LPS通过TLR4影响绵羊输卵管上皮细胞SBD-1的表达

李　琦，智达夫，延　沁，刘默宁，郑欣欣，曹贵方

(内蒙古农业大学兽医学院 动物组织胚胎与发育生物学研究室，呼和浩特 010018)



LPS通过TLR4影响绵羊输卵管上皮细胞SBD-1的表达

李琦，智达夫，延沁，刘默宁，郑欣欣，曹贵方*

(内蒙古农业大学兽医学院 动物组织胚胎与发育生物学研究室，呼和浩特 010018)

摘要：旨在研究脂多糖(LPS)对绵羊输卵管上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)表达的影响及其调控途径，本研究设置不同浓度(10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、1 mg·mL-1)LPS，分别作用不同时间(0、1、3、6、12和24 h)，检测绵羊输卵管上皮细胞SBD-1和Toll样受体-4 (TLR4) mRNA表达水平，通过免疫组化检测SBD-1表达定位，并进一步通过TLR4阻断试验来证实TLR4介导LPS引起SBD-1表达。结果表明，SBD-1蛋白表达于输卵管上皮细胞。LPS以浓度和时间依赖方式影响绵羊输卵管上皮细胞中SBD-1的表达，且100 ng·mL-1LPS在作用12 h后，SBD-1的表达水平达到最高。阻断试验表明，TLR4介导LPS对SBD-1的表达调控。综上表明，LPS可以影响绵羊输卵管上皮细胞表达SBD-1，且该过程通过TLR4介导。

关键词：输卵管；脂多糖；绵羊β-防御素-1；Toll样受体-4

绵羊输卵管炎是一种季节性多发的生殖道炎症，一般由外源微生物感染引起，并导致免疫系统紊乱。在众多的感染源中，由细菌感染引起的输卵管炎最为常见，但是随着细菌对抗生素的抵抗越来越强，传统的抗生素治疗作用越来越小[1]。研究报道，动物体内本身存在的防御素比抗生素具有更直接的抗感染功能[2]。研究防御素的功能及其调节机制非常重要。β-防御素是一种抗菌肽分子，是动物长期进化而来的先天性免疫屏障，广泛表达于哺乳动物和鸟类的黏膜上皮组织，具有广谱抗菌性、抗细胞毒性、抗病毒及调节免疫的作用[3-4]。有报道表明，输卵管中防御素表达量较高，而且细菌感染会刺激防御素表达，并参与免疫排斥反应[5]。革兰阴性菌引起的机体免疫反应主要是其细胞壁组成成分脂多糖(LPS)[6-8]，在体外经LPS刺激，上皮细胞能够分泌与炎症相关的细胞因子，介导炎症反应[9]。β-防御素作为先天性免疫屏障在某些物种中也被证实可被LPS上调[10-13]。LPS需要通过细胞膜表面Toll样受体4(TLR4)才能激活下游信号途径，进而调控防御素表达[14-15]。然而，在绵羊输卵管中LPS是否能影响β-防御素的表达，及是否通过TLR4介导目前尚不清楚。本试验以LPS模拟革兰阴性菌侵染细胞为模型，研究在此过程中，β-防御素的表达情况以及是否通过TLR4介导其表达，为进一步探索输卵管炎发病机理、合理开发及运用输卵管炎相关药物提供理论依据。

1材料和方法

1.1主要试验材料

双抗、0.25%胰蛋白酶购自Gibco。DMEM/F12培养基、胎牛血清、D-PBS购自Hyclone。DNA Marker(DL2000)、反转录试剂盒(No.RR047A)、荧光定量酶SYBR®PremixExTaqⅡ(No.DRR081A)、Premix Ex Tag DNA聚合酶(RR902Q)购自大连宝生物公司。总RNA提取试剂盒(No.220010)购自上海飞捷生物有限公司。LPS(Cat.No.L2880)购自Sigma公司。SBD-1抗体为本实验室制备。免疫组化染色试剂盒、显色剂DAB购自福州迈新生物技术公司。TLR4特异抗体(Cat.No.16-9917-82)购自eBioscience公司。

1.2绵羊输卵管SBD-1的表达定位

取绵羊输卵管壶腹部组织，按常规方法脱水，包埋，切片，37 ℃烘片过夜；切片水化后置于柠檬酸缓冲液(10 mmol·L-1柠檬酸，pH 6.0)中高压修复抗原10 min。PBST 洗3次×5 min，加入0.3%甲醇-H2O2，湿盒中室温孵育10 min，PBS洗3次×5 min。加入山羊血清，37 ℃封闭30 min。再加入制备的SBD-1抗体(1∶700)，4 ℃湿盒中孵育24 h，PBST摇洗3次×5 min。加入二抗工作液(生物素标记)，37 ℃湿盒中孵育30 min，加入三抗工作液(辣根酶标记链霉卵白素)，37 ℃湿盒中孵育30 min。PBST洗3次×5 min。加入DAB，显色2～5 min，自来水冲洗，苏木素染色3 min，0.5%冰醋酸分色，脱水后封片。

1.3细胞培养

取间情期成年绵羊的输卵管壶腹部组织，剪除浆膜和脂肪组织，剖开输卵管，经0.05%胰酶消化后，刮取输卵管内层细胞，经PBS洗涤2次后，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，接种于75 cm2培养瓶中，于37 ℃5% CO2培养箱中培养，传至第2代，血清饥饿处理14 h，进行后续试验。以上所分离得到的细胞，已经过形态学观察和免疫荧光显色等方法鉴定为绵羊输卵管上皮细胞。

1.4细胞干预试验

1.4.1LPS对SBD-1表达的影响取同一批次绵羊输卵管上皮细胞，在细胞培养液中添加不同剂量的LPS 0 ng·mL-1(阴性对照)、10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、1 mg·mL-1，分别培养不同时间0(阴性对照)、1、3、6、12和24 h，收集细胞提取总RNA，通过qRT-PCR检测SBD-1 mRNA表达量变化。

1.4.2LPS对TLR4表达的影响取同一批次绵羊输卵管上皮细胞，添加100 ng·mL-1LPS分别培养不同时间(0、6、12和24 h)，以0 h作为阴性对照。在各相应时间点提取细胞总RNA，通过qRT-PCR检测TLR4 mRNA表达量变化，以确定添加LPS对TLR4表达的影响。

1.4.3TLR4阻断试验取同一批次绵羊输卵管上皮细胞，分成4组，第1组为阴性对照，只添加无血清培养基；第2组添加5 μg·mL-1TLR4特异抗体；第3组添加100 ng·mL-1LPS；第4组添加5 μg·mL-1TLR4特异抗体和100 ng·mL-1LPS。12 h后收集细胞，提取细胞总RNA，通过qRT-PCR反应检测SBD-1表达量变化，以确定LPS对SBD-1表达的影响是否通过TLR4介导。

1.5qRT-PCR检测

参照总RNA快速提取试剂盒说明书提取总RNA，并反转录制备cDNA。以其为模板进行qRT-PCR扩增。总反应体系20 μL：SYBR®PremixExTaqⅡ 10 μL、上下游特异引物各0.4 μL(引物信息见表1)、cDNA 2 μL、无酶水7.2 μL。反应程序：95.0 ℃3 min；95.0 ℃10 s、退火温度(表1)30 s、72.0 ℃10 s，48个循环，并在65.0～95.0 ℃测定熔解曲线。

1.6TLR4 PCR检测

参照总RNA快速提取试剂盒说明书提取总RNA，并反转录制备cDNA。以其为模板进行TLR4 PCR扩增。

1.7统计分析

2结果

2.1绵羊输卵管中SBD-1表达定位

免疫组织化学染色结果如图1 B、C，在黏膜层的上皮细胞表现SBD-1强阳性，组化着色呈棕黄色，越靠近黏膜层边缘着色越深，表明SBD-1表达丰度较高。以IgG代替一抗作为阴性对照，其免疫组化结果如图1 A，未见任何棕黄色染色颗粒。

表1引物信息和qRT-PCR退火温度

Table 1Primers information and annealing temperature for qRT-PCR

2.2LPS对绵羊输卵管上皮细胞SBD-1表达的影响

在输卵管上皮细胞培养中添加不同剂量的LPS，并培养不同时间，考察LPS对绵羊输卵管上皮细胞中SBD-1表达的影响。表2和图2结果表明，在未添加LPS组中，SBD-1的表达量在24 h内变化不大，但是LPS不同浓度(10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、1 mg·mL-1)在不同时间(1、3、6、12、24 h)可以不同程度地促进SBD-1 mRNA表达。10、50和100 ng·mL-1LPS在3 h促进SBD-1 mRNA表达，差异显著(P<0.05)，而200 ng·mL-1和1 mg·mL-1LPS在1 h就可以促进SBD-1 mRNA表达，差异显著(P<0.05)。SBD-1表达在100 ng·mL-1LPS刺激12 h后达到最高，之后则显著下降。相比较100 ng·mL-1LPS组，200 ng·mL-1和1 mg·mL-1LPS对SBD-1的表达促进作用在1和3 h较强，在6、12和24 h较弱。所以确定后续试验添加LPS的刺激浓度为100 ng·mL-1，刺激时间为12 h。

a.P<0.05，10、50、100和200 ng·mL-1以及1 mg·mL-1处理组与对照组之间差异显著；b.P<0.05，50、100和200 ng·mL-1以及1 mg·mL-1处理组与10 ng·mL-1之间差异显著；c.P<0.05，100、200 ng·mL-1和1 mg·mL-1处理组与50 ng·mL-1之间差异显著；d.P<0.05，200 ng·mL-1和1 mg·mL-1处理组与100 ng·mL-1之间差异显著；e.P<0.05，1 mg·mL-1处理组与200 ng·mL-1之间差异显著。★.P<0.05，1、3、6、12和24 h处理组与0 h相比差异显著；☆.P<0.05，3、6、12和24 h处理组与1 h相比差异显著；◆.P<0.05，6、12和24 h处理组与3 h相比差异显著；■.P<0.05，12和24 h处理组与6 h相比差异显著；▼.P<0.05，24 h处理组与12 h相比差异显著

Concentration-and time-dependent increase of SBD-1 mRNA expression by LPS in OOECs.Data represent means ± SD (n=3).a-e indicate the data in the same column differ significantly，a.P<0.05vs. 0 ng·mL-1；b.P<0.05vs. 10 ng·mL-1；c.P<0.05vs. 50 ng·mL-1;d.P<0.05vs. 100 ng·mL-1;e.P<0.05vs. 200 ng·mL-1；★-▼.indicate the data in the same line differ significantly，★.P<0.05vs. 0 h；☆.P<0.05vs. 1 h；◆.P<0.05vs. 3 h；■.P<0.05vs. 6 h；▼.P<0.05vs. 12 h

2.3绵羊输卵管上皮细胞中LPS受体TLR4基因的表达检测

为了探明TLR4在输卵管上皮细胞中的表达情况，本试验通过RT-PCR方法检测输卵管上皮细胞中TLR4的表达情况。如图3所示，不同批次收集的绵羊输卵管上皮细胞中均检测到TLR4表达，TLR4 PCR产物电泳条带大小与引物预期条带大小相符，为197 bp，β-actinPCR产物电泳条带大小为208 bp。

2.4LPS对绵羊输卵管上皮细胞中TLR4表达的影响

在输卵管上皮细胞培养中添加100 ng·mL-1LPS，在不同时间点(0、6、12和24 h)收样，通过qRT-PCR绵羊输卵管上皮细胞SBD-1表达水平(图4)。结果表明，添加100 ng·mL-1LPS后，TLR4表达量在6 h起逐渐增加，但增加不显著，24 h后达到最高峰，且显著高于0 h的表达水平(P<0.05)。

2.5TLR4阻断试验

为证实LPS影响SBD-1表达过程中TLR4的介导作用，通过添加TLR4特异抗体，阻断TLR4活性。经qRT-PCR方法检测各组细胞中SBD-1 mRNA表达水平(图5)。结果表明，单独添加TLR4抗体组，SBD-1表达无显著差异；单独添加LPS可以显著上调SBD-1表达(P<0.01)；而共孵育LPS和TLR4抗体组可明显阻断LPS对SBD-1的上调作用(P<0.01)。结果表明，TLR4介导了LPS对SBD-1表达的上调作用。

3讨论

β-防御素作为一种内源性的抗菌肽分子，以其重要的抗感染功能，成为替代抗生素的新型药物[2]。因此研究β-防御素的调控机制为进一步探索输卵管炎发病机理、合理开发及运用输卵管炎相关药物奠定了理论基础。本研究对SBD-1蛋白在绵羊输卵管组织中的定位进行检测，结果表明，SBD-1特异表达于输卵管的上皮细胞中，固有层细胞有较少量表达，推测在输卵管中上皮细胞主要负责分泌防御素来抵抗细菌感染，证明绵羊输卵管上皮细胞中防御素可以在LPS的刺激下表达。

由于TLR在免疫反应早期阶段可以识别外源病原微生物而引起人们的极大兴趣，其对许多感染性疾病的发生和病理过程产生影响。LPS对TLR4的作用因细胞而异，T.Matsuguchi等[16]证明LPS刺激小鼠外周血巨噬细胞导致TLR4 mRNA水平下降。在小鼠胸腺T淋巴细胞和脾巨噬细胞中，LPS不影响TLR4的表达[17-18]。盛金良等[19]研究表明，LPS的刺激可促进绵羊肺泡巨噬细胞中TLR4水平上升，这与本研究结果一致。本研究结果表明，100 ng·mL-1LPS处理绵羊输卵管上皮细胞24 h可显著促进TLR4 mRNA水平表达。另外，本研究通过在细胞培养过程中添加TLR4中和抗体阻断TLR4活性，检测SBD-1 mRNA表达情况，表明阻断TLR4可以显著降低LPS对SBD-1的刺激作用。S.Y.Yu等[20]在口腔鳞状癌细胞中添加TLR4中和抗体，显著阻断由LPS-EGFR对hBD-3的促进作用，与本研究结果一致。TLR4同样还介导LPS对其他炎症因子的刺激作用，K.Tabeta等[21]证明，添加TLR4抗体可以明显阻断LPS对人牙龈成纤维细胞中IL-6的促进作用。上述结果表明，在绵羊输卵管上皮细胞中LPS通过TLR4膜表面受体影响防御素SBD-1的表达。由于缺乏商品化的TLR4抑制剂，对于TLR4的功能研究只能通过中和抗体进行，但是中和抗体的阻断效率有限，上述研究结果还需要更多的试验来佐证，比如TLR4 siRNA干扰试验。

本研究结果表明，细菌细胞壁主要成分LPS可以显著诱导绵羊输卵管上皮细胞表达SBD-1，而TLR4膜表面受体参与调控过程。本研究对于细菌感染所引起的输卵管炎有进一步的认识，并深入了解LPS引发炎症反应的机制，有助于根据其生理生化特性研发出相应的对抗微生物感染的药物。

参考文献(References)：

[1]ANDRW B.Mastitis-making the right desion[J].DairyFarmer，2003，50(1)：30-31.

[2]YARUS S，ROSEN J M，COLE A M，et al.Production of active bovine tracheal antimicrobial peptide in milk of transgenic mice[J].ProcNatlAcadSciUSA，1996，93(24)：14118-14121.

[3]GANZ T，SELSTED M E，LEHRER R I.Defensins[J].EurJHaematol，1990，44(1)：1-8.

[4]GANZ T.Defensins：antimicrobial peptides of vertebrates[J].CRBiol，2004，327(6)：539-549.

[5]孙岩，王路，温俊歌，等.β-防御素在天然免疫中的作用[J].动物医学进展，2011，32(5)：120-123.

SUN Y，WANG L，WEN J G，et al.β-defensins function in innate immunity[J].ProgressinVeterinaryMedicine，2011，32(5)：120-123.(in Chinese)

[6]KIRSCHNING C J，WESCHE H，MERRILL AYRES T，et al.Human toll-like receptor 2 confers responsiveness to bacterial lipopolysaccharide[J].JExpMed，1998，188(11)：2091-2097.

[7]BECKER M N，DIAMOND G，VERGHESE M W，et al.CD14-dependent lipopolysaccharide-induced beta-defensin-2 expression in human tracheobronchial epithelium[J].JBiolChem，2000，275(38)：29731-29736.

[8]RYAN L K，DIAMOND G，AMRUTE S，et al.Detection of HBD1 peptide in peripheral blood mononuclear cell subpopulations by intracellular flow cytometry[J].Peptides，2003，24(11)：1785-1794.

[9]RYU S J，CHOI H S，YOON K Y，et al.Oleuropein suppresses LPS-induced inflammatory responses in RAW 264.7 cell and zebrafish[J].JAgricFoodChem，2015，63(7)：2098-2105.

[10]SHINOMIYA T，KAWAGUCHI M，OKUBO M，et al.mRNA expression and localization of LPS-induced β-defensin isoforms in rat salivary glands[J].BullTokyoDentColl， 2014，55(3)：139-147.

[11]SONODA Y，ABDEL MAGEED A M，ISOBE N，et al.Induction of avian β-defensins by CpG oligodeoxynucleotides and proinflammatory cytokines in hen vaginal cellsinvitro[J].Reproduction，2013，145(6)：621-631.

[12]FU Y，LIU B，FENG X，et al.Lipopolysaccharide increases Toll-like receptor 4 and downstream Toll-like receptor signaling molecules expression in bovine endometrial epithelial cells[J].VetImmunolImmunopathol， 2013，151(1-2)：20-27.

[13]ALVA-MURILLO N，TÉLLEZ-PÉREZ A D，SAGRERO-CISNEROS E，et al.Expression of antimicrobial peptides by bovine endothelial cells[J].CellImmunol，2012，280(1)：108-112.

[14]TAKEDA K，KAISHO T，AKIRA S.Toll-like receptors[J].AnnuRevImmunol，2003，21：335-376.

[15]POLTORAK A，HE X，SMIRNOVA I，et al.Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice：mutations in TLR4 gene[J].Science，1998，282(5396)：2085-2088.

[16]MATSUGUCHI T，MUSIKACHAROEN T，OGAWA T，et al.Gene expressions of toll-like receptors 2，but not toll-like receptor 4，is induced by LPS and inflammatory cytokines in mouse macrophages[J].JImmunol，2000，165(10)：5767-5772.

[17]AKIRA S.Toll-like receptors and innate immunity[J].AdvImmunol，2001，78：1-56.

[18]MEDVEDEV A E，KOPYDLOWSKI K M，VOGEL S N.Inhibition of lipopolysaccharide-induced signal transduction in endotoxin-tolerized mouse macrophages：dysregulation of cytokine，chemokine，and toll-like receptor 2 and 4 gene expression[J].JImmunol，2000，164(11)：5564-5574.

[19]盛金良，陈创夫，杨霞，等.绵羊Toll样受体家族在肺泡巨噬细胞的分布及脂多糖(LPS)刺激对TLR2、TLR4表达的影响[J].华北农学报，2010，25(1)：30-35.SHENG J L，CHEN C F，YANG X，et al.Distribution of toll-like receptors (TLRs) and TLR2，TLR4 expression during LPS stimulus sheep alveolar macrophage[J].ActaAgriculturaeBoreali-Sinica，2010，25(1)：30-35.(in Chinese)

[20]YU S Y，WANG F，YANG H Y，et al.Human beta-defensin-3 (hBD-3) upregulated by LPS via epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling pathways to enhance lymphatic invasion of oral squamous cell carcinoma[J].OralSurgOralMedOralPatholOralRadiolEndod，2011，112(5)：616-625.

[21]TABETA K，YAMAZAKI K，AKASHI S，et al.Toll-like recceptors confer responsiveness to lipopolysaccharide fromPorphyromonasgingivalisin human gingival fibroblasts[J].InfectImmun，2000，68(6)：3731-3735.

(编辑程金华)

LPS Induces SBD-1 Expression via TLR4 in Ovine Oviduct Epithelial Cells

LI Qi，ZHI Da-fu，YAN Qin，LIU Mo-ning，ZHENG Xin-xin，CAO Gui-fang*

(1.CenterofHistologyandDevelopmentalBiology，CollegeofVeterinaryMedicine，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Huhhot010018，China)

Key words:oviduct；lipopolyscharride；sheep β-defensin-1 (SBD-1)；toll-like receptor 4 (TLR4)

Abstract:The aim of this study was to explore the effect of lipopolyscharride (LPS) on induction of sheep beta defensin-1 (SBD-1) in ovine oviduct epithelial cells (OOECs).In this study，OOECs were cultured and then exposed to LPS for up to 24 hours，with a range of concentrations (10 ng·mL-1-1 mg·mL-1).qRT-PCR was performed to detect SBD-1 mRNA.The results showed that LPS stimulated the expression of SBD-1 in a time-(maximal at 12 hours) and concentration-(maximal at 100 ng·mL-1) dependent manner.Moreover，IHC staining showed that SBD-1 was mainly expressed in epithelial cells.Importantly，TLR4 was detected in OOECs and stimulated by LPS.LPS induced SBD-1 mRNA expression was markedly inhibited by blockage of TLR4 activity using anti-TLR4 antibody.In conclusion，these results suggest that LPS might induce the expression of SBD-1 in the ovine oviduct epithelial cells,and the expression are mediated by TLR4.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.011

收稿日期：2015-06-02

基金项目：国家自然科学基金项目(31360593；31060328)；内蒙古自治区科技计划项目(20130317)

作者简介：李琦(1987-)，女，呼和浩特人，博士生，主要从事组织胚胎学与分子生物学研究,E-mail:liqi253762@163.com *通信作者：曹贵方，教授，博士生导师，E-mail:guifangcao@126.com

中图分类号：S826.2

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)01-0079-06