TLR4信号通路及其负调控研究进展*

吴疑，匡梅综述，周红，潘夕春审校

（第三军医大学药学院药理学教研室，重庆400038）

TLR4信号通路及其负调控研究进展*

吴疑，匡梅综述，周红，潘夕春△审校

（第三军医大学药学院药理学教研室，重庆400038）

受体，细胞表面；膜糖蛋白类；信号处理，计算机辅助的；信号转导；TLR4；脂多糖；负调控

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.18.013

A

1009-5519（2016）18-2821-04

Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是机体天然免疫系统中的模式识别受体，可识别不同的病原体相关分子模式（pathogen-associatedmolecular patterns，PAMPs），从而启动相关的下游信号转导途径［1］。其中，TLR4相对分子质量为90×103～150×103，主要分布于巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、T/B淋巴细胞及上皮细胞，识别革兰阴性（G-）菌的菌壁成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）［2-4］。TLR4为Ⅰ型跨膜受体，由胞外区、跨膜区及胞内区组成。胞外区负责识别配体，由22个长度为20～30氨基酸残基的亮氨酸重复序列（leucine-rich repeat，LRR）组成；跨膜区富含半胱氨酸，决定TLR4的胞膜定位；胞内区包含1个在所有TLRs中序列保守的结构域，即Toll/ IL-1受体（Toll/interleukin-1 receptor domain，TIR）结构域，可招募下游衔接蛋白从而启动下游通路，导致肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factors α，TNF-α）、白介素6（IL-6）等炎症因子的大量释放［5-7］。TLR4通路与感染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮等的发生密切相关，被认为是上述疾病的重要靶点。本文将就TLR4介导的天然免疫信号通路及其负调控的最新进展进行综述。

1　TLR4介导的信号转导途径

1.1LPS诱导TLR4二聚体化LPS主要由3个部分构成：脂质A、核心多糖和O抗原多糖，其中脂质A是诱发TLR4信号转导的主要部分。G-菌的脂质A一般含1条糖胺主链和5～7条脂链。大肠埃希菌和沙门菌的脂质A含2个磷酸基团且其酰基端有6条脂链，研究表明这种结构比其他G-菌有更强的炎性反应活性［1，8］。脂质A的脂链和磷酸基团数量发生改变均可抑制TLR4二聚体化［9-10］。因此，可通过改变脂质A脂链和磷酸基团数量，获得具有阻断TLR4二聚体化活性的LPS类似物作为新型抗生素。

TLR4与髓分化蛋白2（myeloid differentiation protein 2，MD-2）形成异二聚体［1］。MD-2是分泌型糖蛋白，含1个β-折叠和2个β-片层，2个β-片层之间为结合LPS的疏水活性中心。相较于其他β-折叠类蛋白，MD-2的β-片层间无二硫键，因此疏水中心较易暴露。MD-2的疏水中心由大量带正电荷基团修饰，因此易结合两亲性的或带负电荷的配体，如LPS。MD-2只有约1/3部分与TLR4凹面结合，剩余部分结合LPS或其他配体［5］。MD-2与TLR4结合方式：TLR4胞外区N端和中心部分的电荷与MD-2表面电荷互补结合，其结合位点主要分为A、B区。A区负电荷与MD-2表面正电荷作用，B区正电荷与MD-2表面负电荷作用，此外还有氢键等作用参与，使二者表面紧密结合。研究表明，A、B区或亲水基团突变均会影响TLR4与MD-2结合［1］。

LPS首先与血清中LPS结合蛋白（LPS-binding protein，LBP）结合，然后被转运给CD14。CD14是LPS的高亲和力受体，以分泌性蛋白的形式存在或以糖基磷脂酰肌醇形式锚定在巨噬细胞表面，将LPS聚合物分解为单分子并呈递给TLR4∶MD-2复合物［1，9］。随后脂质A的5条脂链都嵌在MD-2的疏水中心，另一条R2脂链则有部分位点暴露，以结合TLR4从而介导TLR4二聚体的形成，最终使LPS结合TLR4和MD-2的聚合物诱导形成“M”形2∶2∶2复合物，启动胞内信号转导。

1.2胞内信号转导TLR4胞内信号通路包括髓分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依赖和非依赖途径，均可通过招募下游衔接蛋白而放大刺激信号，上调炎症基因表达［4，11］。

1.2.1MyD88依赖途径LPS活化的TLR4二聚体可形成高度有序的多聚体，从而更易招募MyD88等衔接蛋白。MyD88包含2个信号转导结构域：C端的TIR结构域，可与TLR、IL-1R和IL-18R的TIR结构域结合；N端的死亡结构域，负责招募下游含死亡结构域的信号分子［5］。TLR4招募MyD88需要MyD88样受体（Mal）的参与。不同于其他含TIR结构域的衔接蛋白，Mal通过其突起的“AB loop”连接TLR4和MyD88，且其N端含磷脂酰肌醇4，5-二磷酸，可与细胞膜上富含TLR4的区域连接，有利于Mal与MyD88结合［12］。

随后MyD88招募IL-1受体相关激酶（IL-1R associated kinases，IRAKs），形成螺旋状的MyD88-IRAK-4-IRAK-1/2复合物（Myddosome）。Myddosome由6个MyD88、4个IRAK-4和4个IRAK-1/2通过死亡结构域连接而成。该复合物形成过程：TLR4首先招募形成6～8个MyD88复合物，此复合物聚集4个IRAK-4使其自身磷酸化，最后结合4个IRAK-1/2亚基［13-14］。随后IRAK1磷酸化并与MyD88脱离，招募并活化肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNFR-associated factor 6，TRAF6），活化的TRAF6招募转化生长因子-β活化激酶结合蛋白抗体1/2/3（TAB1/2/3），形成转化生长因子激酶1（TAK1）复合物［6，15］。TAK1复合物由TAK1及TAB1/2/3构成，其中TAB2介导TAK1和TRAF6的结合，TAB1使TAK1活性增强。TAK1可招募并激活核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）抑制蛋白（IκB）激酶（IκB kinase，IKK），最终作用于IκB并使其磷酸化、泛素化降解，从而导致NF-κB与IκB分离入核，启动或增强炎症基因的转录，促进炎症因子及炎症趋化因子如TNF-α、IL-12的表达［8，16］。TAK1也可招募促细胞分裂激活性蛋白激酶4（mitogenactivatedproteinkinase 4，MKK4），使C-JunN端激酶（JNK）磷酸化，随后JNK激活了激活子蛋白-1（AP-1）转录因子，诱导促炎介质如TNF-α等的表达；TAK1还能招募MKK3和MKK6，诱导p38α活化，从而激活转录因子CREB和c/EBP-β，诱导炎症趋化因子、促炎性细胞因子（IL-10，IL-12）等的表达［6］。除此之外，MyD88、IRAK-1、IRAK-4和TRAF6也可通过干扰素调节因子5（IRF5）作用，促进干扰素表达［17-18］。

1.2.2MyD88非依赖途径研究表明，MyD88基因缺陷小鼠未完全丧失对LPS刺激的反应性，且体内IRF3的活化和干扰素-β（IFN-β）的表达均不受影响，表明TLR4信号转导并不完全依赖于MyD88途径［19］。TLR4也可招募诱导IFN-β含TIR结构域衔接蛋白（TIR domain-containing adaptor inducing interferon β，TRIF），启动后续信号转导。具体过程：Mal磷酸化从膜上解离，从而使LPS/MD-2/TLR4聚合物形成内体；随后TRIF相关接头分子（TRIF-related adaptor molecule，TRAM）介导含TLR4的内体与TRIF结合，其作用与Mal类似，但仅有当TLR4二聚体化且以内体形式存在时，TRAM才会与之连接［8，14，20-21］；随后TRIF招募含RIP同型结构域激酶（RIP homotypic interaction motif containing kinase，RIP1），使RIP1被E3泛素化连接酶Peli1泛素化，最终与IKKγ及TAK1相互作用，通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和NF-κB途径调节炎症基因表达。TRIF也能招募TRAF3，后者自身修饰后与激酶TBK1相互作用，使转录因子IRF3磷酸化并移位到核内，启动Ⅰ型干扰素的表达［3，6，17］。

2　TLR4信号通路中的负调控因子

TLR4信号通路是天然免疫系统中最重要的致炎信号通路之一，是治疗感染性炎症的重要靶点。本部分从抑制TLR4表达、TLR4二聚体化及信号转导3个不同层面，对现有的负调控因子研究进展进行综述。

2.1抑制TLR4表达定量RT-PCR和荧光素酶报告基因实验证实，let-7家族的miRNA let-7i在转录后水平与TLR4mRNA的3′-非翻译区相互作用，抑制其表达［2，22］。阿托伐他汀可显著上调miRNA let-7i从而抑制TLR4、NF-κB表达，减弱信号转导。动脉粥样硬化患者使用阿托伐他汀后，体内miRNA let-7i表达升高而TLR4表达降低。阿托伐他汀还可通过干扰胞膜脂筏形成，影响TLR4聚集，导致MyD88招募和通路活化受阻。临床研究表明，阿托伐他汀和替米沙坦联合治疗可减少动脉粥样硬化患者巨噬细胞中IRAK-1、TRAF6和TLR4的mRNA表达。该过程中TLR4不是直接靶点，这也给抗感染治疗提供了一个新的思路。阿托伐他汀是广泛应用于临床的降脂药，其安全性高、作用机制明确，可作为治疗G-菌感染或TLR4信号通路介导的其他疾病的候选药物［2，15，23］。

2.2抑制TLR4二聚体化单磷酰脂质A（monophosphory lipid A，MPLA）是人乳头瘤病毒和乙型肝炎病毒疫苗的组成成分，是现今唯一商业化作用于TLR4途径的疫苗佐剂。在乙型肝炎疫苗中加入MPLA，可显著提高免疫受损患者的体内抗体浓度［8，24］。MPLA是沙门菌脂质A的衍生物，较脂质A少一个磷酸基团，其与TLR4的结合位点及形成的TLR4-MD-2二聚体结构与脂质A高度相似。但MPLA较LPS致炎活性减弱，原因可能是其缺少磷酸基团，与带正电荷的TLR4-MD-2的亲和力减弱，因而诱导二聚化的能力也相应减弱［5］。在非灵长类动物皮内注射MPLA，发现其能招募抗原提呈细胞，且能诱导抗原特异性T细胞扩增，因而可作为疫苗佐剂［8，25］。

姜黄素为酸性多酚类物质，是姜黄根的主要组成成分，主要在膳食和传统饮食中作为添加剂使用。其在HEK-TLR4细胞中可与LPS竞争性结合MD-2，从而抑制TLR4二聚体形成，阻断LPS/TLR4信号转导。因而姜黄素也作为候选药物进行研究［26］。

2.3阻断胞内信号转导

2.3.1作用于衔接蛋白生长停滞特异基因Gas6是一种分泌蛋白，与抗凝素蛋白氨基酸序列同源度为46%，能特异性激活TAM受体酪氨酸激酶，TAM与Ⅰ型干扰素受体（IFNR1）结合，通过IFNR1激活信号传导及转录激活因子1（STAT1），活化的STAT1能促进细胞因子信号抑制物1（SH2 domain of suppressor of cytokine signaling 1，SOCS-1）和SOCS-3的表达，其中SOCS-1可以辅助Mal泛素化降解，阻断信号转导。实验表明，SOCS-1转基因小鼠对LPS没有反应，SOCS-3可作用于TRAF3，阻断下游信号通路［3，27］。

单核细胞受到LPS诱导后，MyD88剪接体（MyD88s）表达增加，MyD88s与MyD88竞争性结合MyD88，形成不能与IRAK-4相互作用的MyD88与MyD88s二聚体，从而抑制下游信号转导［3］。含金结构域TRAM接头蛋白（TAG）是TRAM的一种剪接体，存在于内质网和静息细胞的早期内体中。当细胞受到LPS刺激时，TAG转移到晚期内体中干扰TRAM与TLR4的结合，抑制Ⅰ型干扰素生成。实验表明，TAG敲除小鼠体内TLR4降解速度减慢，表明TAG可促进TLR4降解［20，27］。

2.3.2作用于激酶IRAKsIRAKM属于IRAK家族，但缺少其相似物IRAK-1/2和IRAK-4的激酶活性。IRAKM阻碍IRAK-1/IRAK-4与MyD88的分离，由此抑制IRAK-1与TRAF-6的结合，从而阻断下游信号转导［28］。

2.3.3作用于TRAFs去泛素化酶锌指蛋白A20也称作TNF-α诱导蛋白3（TNF-α-induced protein 3，TNFAIP3），是一个由Tnfaip基因编码的去泛素化酶。A20特异性识别TRAF6并使其去泛素化，从而阻断TRAF6与多聚泛素链的连接，抑制TLR4信号转导［3，6，27］。

肠道细菌如大肠埃希菌和沙门菌作用于肠上皮细胞，然而尽管有TLR存在，肠上皮细胞对病原体的反应较其他细胞偏弱。其原因是肠上皮细胞表达一种负调控TLR信号转导因子——单个抗体白介素1相关受体（single Ig IL-1 related receptor，SIGIRR），其可使IRAK与TRAF6分离，具体机制不明。SIGIRR基因缺陷小鼠感染出血性大肠埃希菌后，其肠上皮细胞扩增且致炎因子表达增多，表明SIGIRR可抑制TLR通路［29］。

酪氨酸磷酸酯酶（src-homology-region-2-domaincontaining phosphatase，SHP）可通过抑制TRAF6泛素化从而阻断TLR4信号转导。实验表明，SHP敲除小鼠在LPS应答中的TNF，可使IL-1β、IL-6表达增高；骨髓来源细胞的SHP能保护SHP缺陷小鼠，防止LPS诱导休克的发生，表明SHP对TLR4通路有负调控作用。进一步研究表明，SHP生成依赖于Ca2+依赖的AMP激活蛋白激酶途径［27］。

2.3.4作用于TLR4通路其他分子黏附/消除病原体的Ⅲ型效应蛋白转位紧密黏附素受体（translocatedintimin receptor，Tir）可与细菌菌膜上的紧密黏附素直接结合，从而与宿主细胞的胞膜融合。其有黏附及抹平作用，也可抑制体内天然免疫应答。Tir与含免疫受体酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motifs，ITIMs）有相似序列，这种基序在免疫抑制子中常见。Tir被分泌到宿主细胞内，其ITIM样基序促进SHP-1的招募，使NF-κB和MAPK去磷酸化失活；其与TRAF6结合后可阻断TRAF6多聚泛素化链形成及后续TAK1的激活；其在胞内以Tir-SHP-1-TRAF6复合体形式抑制NF-κB和MAPK途径的信号转导［3，30］。

抑制性锌指蛋白Traid3A是有E3泛素化连接酶活性的环指蛋白，包含TIR结构域。Traid3A随TRAF3的减少而增多，且其作用具有剂量依赖性。Traid3A过量表达促进了TLR4的降解；也可使TRAF3第48位的赖氨酸位点泛素化，导致TRAF3的构型翻转及第396位的丝氨酸位点磷酸化，从而抑制IRF3的激活［3，20］。

3　小结

综上所述，TLR4介导的天然免疫信号转导分为三步：首先LPS诱导TLR4二聚体化，然后通过MyD88依赖和非依赖途径招募衔接蛋白，最终导致核因子活化和促炎因子基因的表达。由于LPS诱导炎症因子的过度释放导致脓毒症、感染性休克等危重症的发生，LPS/TLR4通路的负调控策略成为研究热点。根据TLR4通路的不同阶段，可将现有负调控因子分为三类：一是TLR4表达抑制剂，如阿托伐他汀、miRNA let-7i等；二是TLR4二聚体化抑制剂，如MPLA、姜黄素等；三是TLR4通路分子抑制因子，如Gas6、Traid3A等。对上述TLR4通路负调控因子中抑制作用明显、机制明确的分子进行体内外药效学研究、结构改造等深入探索，有助于研发新的TLR4通路靶向药物，为治疗G-菌感染导致的感染性休克、脓毒症，以及肿瘤、自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮等提供新的候选药物。

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国家自然科学基金资助项目（81202325）。

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（2016-05-22）