血清miRNA-208和β-肌球蛋白重链在心力衰竭患者中的表达及其意义

马 晶 李锦玉⋆

血清miRNA-208和β-肌球蛋白重链在心力衰竭患者中的表达及其意义

马 晶 李锦玉⋆

目的 检测微小RNA（miRNA）-208及β-肌球蛋白重链（β-MHC）在心力衰竭患者血清中的表达变化及相互关系。方法 收集因心力衰竭入院的患者60例（心力衰竭组）和健康体检者56例（对照组），应用实时荧光定量PCR法检测血清中miRNA-208、β-MHC的表达，超声心动图评估左室质量指数（LVMI）、左室射血分数（LVEF）情况。结果 心力衰竭组血清中miRNA-208、β-MHC表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。miRNA-208表达水平与LVMI呈正相关（P＜0.05），与LVEF呈负相关（P＜0.05）。β-MHC与miRNA-208表达水平呈正相关（P＜0.05）。结论 心力衰竭患者miRNA-208表达增高及相应的正向上调β-MHC水平可能是心力衰竭心肌重构的机制之一，与心力衰竭的发生发展有关。

心力衰竭 微小RNA 肌球蛋白重链 左室质量指数

心脏负荷增加、氧化应激反应等均可导致心室重构。β-肌球蛋白重链（β-MHC）是心脏最主要参与收缩功能的蛋白。微小RNA（miRNA）是一类非编码单链RNA分子，广泛而稳定的存在于人类细胞外液中，可与mRNA特定位点结合，抑制特定的靶基因，从而参与炎症反应、细胞凋亡等多种病理过程。研究发现，miRNA参与多种心血管疾病病理生理进程的发生发展。miRNA-208是目前发现唯一的心脏特异性表达的miRNA，其可通过调控β-MHC参与心肌代谢进程。本研究测定心力衰竭患者和健康人群血清中miRNA-208、β-MHC表达水平，评估左室质量指数（LVMI）、左室射血分数（LVEF），探讨心力衰竭患者血清中miRNA-208与β-MHC的表达水平改变与心室重构的关系，报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 选择2015年8月至2016年1月在本院心内科住院的心力衰竭患者60例为心力衰竭组，其中男39例，女21例，平均年龄（68.42±7.73）岁。其中扩张型心肌病16例，冠心病15例，高血压性心脏病15例，风湿性心脏病14例。均符合美国纽约心脏病协会（NYHA）心功能分级II～IV级，且心脏彩色多普勒超声检查确诊心功能不全。另选择同期本院健康体检者56例为对照组，其中男40例，女16例，平均年龄（67.29±6.72）岁。对照组纳入标准：无胸闷胸痛气促史，体检正常，血压、心电图、血糖、血脂、心脏超声正常者。两组在年龄、性别、体质量指数等临床资料的基线特征差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。两组受检者均为自愿参加并签署知情同意书。

1.2 方法 （1）标本收集及储存：采集晨时空腹＞12h肘静脉血6ml，按照RNA提取试剂盒说明离心取血清，储存于-80℃冰箱中备用。（2）检测方法：miRNA-208、β-MHC的测定采用美国应用生物系统公司生产的ABI7500的实时荧光定量PCR仪，按照试剂盒说明书提取总RNA，使用逆转录试剂盒逆转录合成cDNA，进行定量PCR检测miRNA-208、β-MHC表达水平，U6作为内参，使用相对定量方法（2-ΔΔCt）计算miRNA-208、β-MHC表达量。miRNA-208上游引物为5'-GTCAGTTTGTCAAATACC-3'，下游引物为5'GAGCAGGCTGGAGAATAG3'。β-MHC上游引物为5' GTGCGACAACACTTATGA3'，下游引物为5' AAACAGCCGTCCTGAGAT3'。采用Aspen彩色多普勒超声仪器，观察对象左侧卧位，心脏超声测量左心室舒张末内径（LVEDD）、舒张末期室间隔厚度（IVST）、左室后壁厚度（LVPWT）。左室质量（LVM）的计算采用Devereux等推荐的公式［1］：LVM（g）=0.832［（LVEDD+IVST+LVPWT）3-LVEDD3］±0.6；体表面积（BSA）=0.0061×身高（cm）+0.0128×体质量（kg）-0.1529。LVMI（g/m2）=LVM/BSA。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验。两两相关分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清中miRNA-208、β-MHC表达水平比较 心力衰竭组血清中microRNA-208、β-MHC表达水平较对照组明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 两组血清微小RNA-208、β-MHC表达水平、LVMI、LVEF比较（x±s）

2.2 血清miRNA-208表达水平与左室质量指数、心功能相关性分析 相关分析显示，microRNA-208表达水平与左室质量指数呈正相关（r=0.439，P＜0.05），与LVEF呈负相关（r=-0.324，P＜0.05）。

2.3 血清β-MHC表达水平与左室质量指数、心功能相关性分析 β-MHC表达水平与左室质量指数呈正相关（r=0.416，P＜0.05），与LVEF呈负相关（r=-0.320，P＜0.05）。

2.4 血清β-MHC与miRNA-208表达水平相关性分析 β-MHC与miRNA-208表达水平呈正相关（r=0.376，P＜0.05）。

3 讨论

微小RNA是基因非编码区转录产生的单链小分子RNA，由含茎环结构的miRNA前体剪切而成。从1993年Lee等发现第一个miRNA至2008年引入生物标志物研究领域，其迅速成为研究的热点，有望成为新一代心血管疾病的生物标志物，评估心血管疾病诊疗预后。mRNA有2～7个核苷酸可识别结合miRNA，尤其是3'端非翻译区上核苷酸序列，与miRNA结合介导转录后的基因调控［2］，参与心血管系统疾病的多种病理生理过程，如细胞增殖、分化、凋亡、纤维化、衰老及癌变等。在动脉粥样硬化斑块形成中，miRNA可分别调节平滑肌细胞的表型转化、增值、迁移［3］。心力衰竭作为各种心血管疾病进展的终末阶段，有着复杂的病理生理改变。心肌重构是心力衰竭发生、发展的重要环节。已有研究发现，miRNAs在心力衰竭的发生发展过程中发挥重要调节作用。miRNA-208是心脏特异性miRNA，在血液中含量稳定，调控心血管细胞的生成、发育、损伤修复等心血管生理病理过程。Wilson KD等［4］研究发现，miRNA-1、miRNA-133和miRNA-208高表达于人类胚胎干细胞衍生的心肌细胞和胎儿心脏。心肌梗死后数小时内有多种miRNAs表达升高，如miRNA-1，miRNA-33，miRNA-499和miRNA-208a等［5］。既往研究发现，心肌梗死大鼠的miR-208表达下调，可能与心梗后心室重构相关。本资料中比较了心力衰竭患者与对照组，结果显示，心力衰竭组的血清miRNA-208表达水平较对照组显著升高，提示miRNA-208与心力衰竭可能存在相关关系。miRNA-208表达水平与左室质量指数呈正相关，与LVEF呈负相关，提示miRNA-208与左室重构有正相关性，可能参与了心力衰竭患者的解剖重构。

肌球蛋白是心肌重要的收缩蛋白，由两条重链（α-MHC，β-MHC）和四条轻链组成，在心肌肥厚的发生过程中起重要作用。心肌肌球蛋白重链表达产物有三种二聚体，即α-α同二聚体（Vl型）、αβ-异二聚体（V2型）和β-β同二聚体（V3型），V1型收缩活性最强，V3型收缩活动最低。心肌肥厚与肌球蛋白“胚胎化”密切相关，即肌球蛋白重链α基因表达下调伴随着肌球蛋白重链β基因表达上调，表达产物由Vl型向V3型转化，心肌收缩力下降，这一过程受多种微小核糖核酸调控。Krieger等［6］报道，微囊素-1基因敲除致自发性心肌肥厚大鼠模型中，其心肌β-MHC表达增加。心肌肥厚与MHC基因表达的转变有关［7］。大鼠心肌细胞miRNA-208a过表达时，β-MHC蛋白表达也相应增加［8］。miRNA-208缺失突变的动物在甲状腺素作用下心脏中的β-MHC不会过度表达，同时发现miRNA-208缺失的小鼠出生前β-MHC并未有明显变化，miRNA-208对β-MHC的调节主要表现为出生后调节［9］。本研究比较了心力衰竭患者与对照组的β-MHC表达水平，研究显示，血清中β-MHC表达水平在心力衰竭组中显著升高，β-MHC表达水平与左室质量指数呈正相关，与LVEF呈负相关，提示β-MHC与左室重构有正相关性，可能参与心力衰竭患者的解剖重构。miRNA-208与β-MHC表达水平呈正相关，二者均与LVEF呈负相关，提示miRNA-208可能通过介导β-MHC正向上调参与心力衰竭的发生发展。β-MHC的表达上调使表达产物由Vl型向V3型转化，从而导致心肌收缩力下降，加重心肌重构及心功能的恶化。

总之，miRNA-208表达水平在心力衰竭组中显著升高，并与左心室质量指数相关，miRNA-208可能参与心力衰竭患者的解剖重构，是心力衰竭心肌重构的机制之一，测定miRNA-208可反映心肌重构的程度。心力衰竭患者血清miRNA-208过度表达，相应的介导β-MHC正向上调，从而参与心力衰竭的发生发展及心功能的恶化，miRNA-208将可能是心力衰竭诊断的新的定量生物标记物及潜在的治疗靶点。

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Objective To investigate change and relationship of microRNA-208（miRNA-208）and β myosin heavy chain（β-MHC）expressions in patients with heart failure. Method There were 60 patients being defnitely diagnosed heart failure and 56 healthy controls to be selected. Quantitative real time polymerase chain reaction was applied to assess expressions of miRNA-208 and β-MHC. Transthoracic echocardiographic examination were performed to assess the left ventricular mass index（LVMI）and the left ventricular ejection fraction（LVEF）. Results The expressions of miRNA-208 and β-MHC markedly increased in heart failure Compared with normal subject. The expressions of miRNA-208 and β-MHC were positively correlated with the LVMI（P＜0.05）and negatively with LVEF（P＜0.05）. The expressions of miRNA-208 were positively correlated with the expressions of β-MHC（P＜0.05）. Conclusion Expression of miRNA-208 level was signifcantly up-regulated in human patients with heart failure，possibly contributing to up-regulation of β-MHC leading to the development of heart failure. These results provide potential new insights into molecular mechanisms of heart failure.

Chronic heart failure MicroRNA Myosin heavy chain Left ventricular mass index

201399 上海市浦东医院（复旦大学附属浦东医院）

*通信作者