超滤浓缩-HPLC法测定乳中乳铁蛋白质量分数及功能性评价

刘秀清1，姜金斗，陶大利

(1.黑龙江省食品药品检验检测所，哈尔滨150088；2.农业部乳品质量监督检验测试中心，哈尔滨150090）

超滤浓缩-HPLC法测定乳中乳铁蛋白质量分数及功能性评价

刘秀清1，姜金斗2，陶大利2

(1.黑龙江省食品药品检验检测所，哈尔滨150088；2.农业部乳品质量监督检验测试中心，哈尔滨150090）

建立了超滤浓缩-高效液相色谱法测定乳中乳铁蛋白的方法。该方法样品处理为样品用磷酸盐缓冲液稀释后，样液先通过肝素免疫亲和柱净化、磷酸氢二钠-氯化钠溶液洗脱，然后采用超滤浓缩后直接测定。采用紫外检测器检测。本方法检出限为0.01 mg/100 g。该法具有样品处理简单方便，灵敏度高，重现性好，分析时间短等优点。该方法测定的为具有活性功能的乳铁蛋白含量，解决了乳铁蛋白质量分数较低的生乳及各类液态乳只采用肝素亲和柱净化后测定灵敏度不能满足测定要求的问题，对评价乳的营养价值提供准确数据。

超滤浓缩；乳；乳铁蛋白；高效液相色谱

0 引言

乳铁蛋白（Lf）是乳中特有的功能性成分，主要功能有促进铁吸收、抗菌、提高免疫力[1]等。常乳中平均质量浓度是0.3 mg/mL左右[2]。由于乳中的乳铁蛋白一旦变性将失去活性，其相应的功能大幅降低。所以对深度受热加工的乳品而言，其功能性将大打折扣。目前测定乳铁蛋白测定方法时有报道，主要有高效毛细管电泳法、酶联免疫法、液相色谱法、SDS-PAGE法等[2-8]。除酶联免疫法外，大都测定的为乳铁蛋白总量，特别是只采用肝素亲和柱净化-液相色谱测定的方法其检出限（0.6 mg/100g）不能满足乳中乳铁蛋白检测的要求。本研究是在免疫亲和柱净化后的基础上，结合超滤去除大部分水分达到浓缩的目的，其灵敏度可较其他方法提高10倍以上，从而满足了非添加、低质量分数非变性乳铁蛋白的定量测定，对评价乳的营养价值提供技术支持。

1 实验

1.1试剂

甲醇、无水乙醇为色谱纯；三氟乙酸；磷酸氢二钠溶液(0.20 mol/L)：称取28.4 g磷酸氢二钠，加800 mL水溶解，用磷酸调pH值至8.00±0.5，加水定容至1 000 mL；磷酸氢二钠-氯化钠溶液：称取7.10 g磷酸氢二钠，58.4 g氯化钠，加适量水溶解，用磷酸调pH值至8.00± 0.5，加水定容至1 000 mL；乳铁蛋白标准品标准品(纯度大于98%)。

1.2仪器及材料

Waters 2695高效液相色谱、2489紫外检测器；冷冻离心机转速≥10 000 r/min；固相萃取装置；肝素亲和柱（1mL）：于4℃冰箱内储存；离心式超滤管：截留分子量10 ku和30 ku；0.45 μm微孔水相滤膜。

1.3色谱条件

色谱柱：C4，5 μm，300 Å。（孔径），250 mm×4.6 mm（内径）；柱温为30℃；流速为1.0 mL/min；进样量为50 μL；流动相为质量分数0.1%三氟乙酸溶液和乙腈，梯度洗脱。

1.4样品处理

（1）样品提取。准确称取10 g(精确至0.01 g)试样于50 mL离心管中，加入10 mL磷酸氢二钠溶液,涡旋振荡器振荡0.5 min，4℃下以8 000 r/min转速离心15 min，将上清液转移到另一50 mL离心管中。再加入5 mL磷酸氢二钠溶液重复操作一次，合并两次液体作为样品提取液备用。

（2）净化浓缩。肝素亲和柱先加入5 mL磷酸氢二钠溶液平衡，处理完毕后加入样品提取液，待样液完全流出后，再用10 mL磷酸氢二钠溶液淋洗，弃去全部流出液。最后用3.0 mL磷酸氢二钠-氯化钠溶液洗脱，全部流出液收集于超滤管中，放于离心机以4 000 r/min转速离心至1 mL以下，在用磷酸氢二钠-氯化钠溶液定容至1 mL。溶液膜过滤后供液相色谱检测分析用。

2 结果与讨论

2.1样品处理的优化

由于乳中蛋白质及脂肪含量较高，干扰物质较多等，特别是脂肪对亲和柱净化时将产生严重干扰，所以需先通过离心除去脂肪。由于该亲和柱对乳铁蛋白的专一性吸附较强，而对其他蛋白（包括乳铁蛋白在内的变性蛋白）无吸附，所以在样品前处理中无需考虑蛋白的影响。另一方面亲和柱需在适宜的酸度条件下才可达到最佳效果，为此在样品处理中采用样液与缓冲液1:1即可符合此要求。通过上述处理后即可直接将样液通过肝柱亲和柱净化。

2.2肝素亲和柱性能的测定

该方法应首先确保采用为肝素亲和柱净化的效果，为此需对该亲和柱进行验证。本实验设计了不同上样量、不同吸附洗脱的速度测试，通过测定回收率进行了最佳净化条件的考察。首先采用含有0.5 mg的标准乳铁蛋白溶液按1，2，3，4，5 mL/min吸附、洗脱相同的速度进行测试；在室温条件下证明当流速高于2 mL/min时其效果显著下降；当超过4 mL/min时回收率仅83.3%，说明流速过快对吸附洗脱效果影响显著（见表1）。然后选用不同上样量以2 mL/min的吸附洗脱速度测试的回收率在96%以上，证明该免疫亲和柱性能优良（见表2）。

表1 不同吸附洗脱速度对乳铁蛋白测定结果的影响

表2 肝素亲和柱性能验证结果

2.3超滤管类型的选择

离心式超滤管的主要作用是将样液中的水分及较低分子量的物质通过超滤膜大部分被去除，如本研究中样品洗脱液约为3 mL,通过超滤膜分离后可浓缩至1 mL,相当于又将样品的检测灵敏度提高3倍。从而满足了低含量乳铁蛋白样品的测定。由于超滤管离心过滤中会使一定分子量的物质被过滤掉，若选用靠近乳铁蛋白约为80 ku分子量的是不可以的，最好选择目标物分子量1/3以下的膜才可确保不损失；同时考虑到膜过滤的主要目的是为了去除水分及部分低分子物质，若选择低分子量的膜过滤其效率就会大大降低。为此本研究选择了截留分子量分别为10 ku和30 ku的离心式超滤管进行实验。其方法是先用配制磷酸氢二钠-氯化钠溶液含有质量浓度为50 g/mL和120 g/mL的两个标准溶液，分别吸取3 mL（浓缩后乳铁蛋白分别相当于150 μg与360）将上述标准溶液移入超滤管中，按1.4.2离心定容后上机测定，实验结果如表3所示。

表3 不同规格超滤管对乳铁蛋白损失率的影响

表3表明：所选两种规格的超滤管对乳铁蛋白基本无损失，考虑到过滤速度30 ku规格的超滤管优于前者，本研究采用该超滤管。

2.4线性范围与检出限

在上述的最佳色谱条件下,根据乳中乳铁蛋白质量浓度范围及样品处理方法，配制成乳铁蛋白标准工作液为30，100，200，300，500 μg/mL系列质量浓度,采用外标峰面积法定量。经测定，在该系列质量浓度范围内呈良好的线性关系,线性回归方程为y= 0.00051x-3.36(x为峰面积；y为质量浓度，μg/mL)，相关系数r=0.9998（见图1）。以本底3倍噪音计算样品最低检出限为0.0 1mg/100mL。

2.5方法的回收率和精密度

分别选取生牛乳与灭菌乳添加乳铁蛋白标准溶液后进行样品处理，测定回收率；用生牛乳与灭菌乳样品处理液分别进样6次测定精密度。两样品不同添加量回收率在85～96%间，平均为92.7%；生牛乳样品平均RSD%为2.65，灭菌乳为11.98%，平均RSD%灭菌乳远大于生牛乳的原因主要是灭菌乳中非变性乳铁蛋白质量分数较低（在检出限附近），测定时基线干扰所致。回收率与精密度测定结果分别如表4和表5所示。

图1 乳铁蛋白标准曲线

图2 乳铁蛋白标准品色谱

图3 样品乳铁蛋白色谱质量浓度/（μg·mL-1）

表4 样品中乳铁蛋白回收率测定结果 μg/100g

表5 样品乳铁蛋白精密度测定结果

2.6样品测定

通过对生乳灭菌纯牛乳共6个样品，采用建立的方法对乳铁蛋白质量分数的测定，证明对质量分数大于0.01 mg/100 mL样品中的非变性乳铁蛋白可定量测定，如表6所示。

表6 生乳与灭菌乳中乳铁蛋白测定结果 μg/100g

测定结果表明，生乳经超高温灭菌后，乳铁蛋白的活性几乎损失殆尽，其质量分数甚至在检出限以下，其乳的营养养价值大大降低。从而为评价乳的功能性提供技术支持。

3 结论

（1）本研究建立了乳中乳铁蛋白的肝素亲和柱净化、超滤浓缩、高效液相色谱测定方法。该法具有样品处理简单、快速准确、灵敏度高等优点。特别是经过超滤浓缩后可满足低质量分数乳中非变性乳铁蛋白的测定。为评价乳中乳铁蛋白的营养价值提供了可靠的技术。

（2）通过对肝素亲和柱性能的测试，吸附洗脱速度应控制在2 mL/min以内；不同标准浓度乳铁蛋白回收率在97～99%间，性能可靠。

（3）通过对样品前处理方法的优化，确定了采用缓冲液处理、离心脱脂、肝素亲和柱净化及超滤浓缩的方法，无需沉淀去除蛋白质，通过亲和柱净化与色谱柱分离可达到乳铁蛋白的基线分离，无干扰。最低检出限为0.01 mg/100g。

（4）该方法线性范围好，在30～500 g/mL的质量浓度范围内呈良好的线性关系。,线性回归方程为y= 0.00051x-3.36(x为峰面积；y为质量浓度，μg/mL)，相关系数r=0.9998。

（5）样品加标回收率在86～96%间，平均为92.7%，生牛乳样品平均RSD为2.65%，灭菌乳为11.98%，完全能满足乳中乳铁蛋白的定量测定的要求。

（6）通过对生牛乳及灭菌乳中乳铁蛋白测定，表明通过超高温灭菌后的乳中几乎检不出非变形乳铁蛋白的含量。说明乳的功能性成分大打折扣。从而为评价乳的功能性提供一可靠地检测方法。

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Ultrafiltration-Determination of lactoferrin in milk by HPLC and evaluate the function

LIU Xiu-qing1，JIANG Jin-dou2，TAO Da-li2
(1.Heilongjiang Institute for Food and Drug Control Harbin 150088,China;2.Ministry of Agriculture Dairy Quality Su⁃pervision and Testing Center，Harbin 150090，China)

To establish a method for determination of lactoferrin in milk by ultrafiltration and HPLC.The method of sample treatment for samples with phosphate buffer diluted sample solution by heparin immunoaffinity column,two sodium hydrogen phosphate Sodium Chloride Solution elution,then using ultrafiltration after direct determination by UV detector.the detection limit of the method is simple and conve⁃nient,this method has high sensitivity for 0.01 mg/100g,good reproducibility,short analysis time.The method for the determination of lacto⁃ferrin has active function,solves all kinds of raw milk and liquid milk lactoferrin mass fraction low production only The determination of the sensitivity of the heparin affinity column after purification can not meet the requirements of the measurement,and provide accurate data for evaluating the nutritional value of milk.

Ultrafiltration；milk；lactoferrin；HPLC

TS252.7

A

1001-2230（2016）11-0053-04

2016-05-20

公益性行业（农业）科研专项经费资助（201403071）。

刘秀清（1974-），男，高级工程师，主要从事食品质量安全与检测技术研究。

姜金斗