QuEChERS-HPLC-MS/MS法检测液态乳中9种β2-受体激动剂残留量

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，农业部食品质量监督检验测试中心（杨凌），陕西杨凌712100）

QuEChERS-HPLC-MS/MS法检测液态乳中9种β2-受体激动剂残留量

李婧妍，郭春锋，崔立辉，刘拉平

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，农业部食品质量监督检验测试中心（杨凌），陕西杨凌712100）

建立了QuEChERS-液相色谱串联质谱法同时检测液态乳中9种β2-受体激动剂药物残留量方法。样品以乙腈、EDTA-Mcllvaine缓冲液和三氯乙酸为提取试剂、NaCl为吸水剂，PSA为吸附剂进行净化。用Shim-pack XR-ODS(3.0mmi.d× 75mm)色谱柱分离，以乙腈溶液和0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，电喷雾正离子模式(ESI+)电离，多反应监测（MRM）模式检测。结果表明，样品经QuEChERS处理后，9种β2-受体激动剂在1.0～200 μg/kg范围内具有良好的线性关系，相关系数（r2）大于0.991，检出限（LOD）范围为0.03～0.13 μg/kg，定量限（LOQ）范围在0.1～0.4 μg/kg之间。回收率介于78.2%～96.0%之间，相对标准偏（RSD）均低于13.7%之间。

液态乳；β2-受体激动剂药物残留量；QuEChERS；高效液相色谱-串联质谱

0 引言

β2-受体激动剂是一类乳制品中经常能够检出的兽药之一，具有促进动物体内脂肪分解和提高瘦肉率等功效[1]。目前，检测-受体激动剂的方法有GC-MS[2]、HPLC-MS/MS[3]、ELISA[4]和HPLC[5-7]。我国和国际上常用的β2-受体激动剂确证方法为HPLC-MS/MS法，但该方法前处理环节存在有机溶剂消耗量大、操作复杂等缺陷。因此，需建立高通量、高灵敏度、简单快速的针对液态乳中β2-受体激动剂残留的专项方法。

QuEChERS提取方法在兽药残留检测方面得到广泛引用[8]。利用该方法，研究人员已有效提取液态乳中固醇类激素[9]和β2-内酰胺类[10]残留，但关于提取β2-受体激动剂的方法还未见报道。因此本研究用QuEChERS方法进行前处理，HPLC-MS/MS法检测液态乳中的β2-受体激动剂类兽药残留量。

1 实验

1.1仪器

高效液相色谱仪（岛津LC-2010A）-串联质谱仪（AB 4000 QTRAR），配有电喷雾（ESI）离子源；涡旋混合器（KQ-250DE）；高速冷冻离心机；十万分之一分析天平；氮吹水浴浓缩仪（DCY-III）。

1.2标准品和试剂

克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林标准品（纯度≥99%）；西马特罗、非诺特罗、氯丙那林、妥布特罗、喷布特罗标准品（纯度纯度≥99%）。C18、PSA、NH2和中性氧化铝吸附剂购自天津博纳艾杰尔公司。乙腈、甲醇为色谱纯；其他试验用试剂均为分析纯；试验所用液态乳。实验室用水为去离子水。

1.3色谱条件

色谱柱为 Shim-pack XR-ODS(3.0mmi.d× 75mm)；流动相A为0.1%（体积分数）甲酸水，流动相B为0.1%甲酸乙腈。梯度洗过程序：0 ～1.5 min，流动相B为90%（体积分数）；1.5 ～9 min，流动相B由90%降至5%；9 ～11 min，流动相B由5%升至90%；11.1 ～15 min，B为90%。流速为0.3 mL/min；进样量10 μL。ESI源正离子扫描；动态多反应监测。

1.4标准溶液配制

精确称取各种标准10.0 mg，分别置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即为质量浓度为0.1 mg/mL的标准储备液。吸取上述溶液各1 mL加入到100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即质量浓度为1.0 μg/mL的混合标准物质中间贮备液。吸取中间贮备液1 mL，用甲醇定容至100 mL，即为9种β2-受体激动剂质量浓度为10 ng/mL的标准溶液。

1.5样品前处理方法

称取样品2 g液态乳样品置于50 mL离心管中，加入2 mL浓度为0.1 mol/L的EDTA-Mcllvaine缓冲液、8 mL乙腈溶液和1 mL三氯乙酸，涡旋混合2 min，以10 000 r/min离心5 min。将上清液移入另一50 mL离心管中，加入6 g的Na2SO4，涡旋混合2 min，以10 000 r/min离心5 min。吸取2 mL提取液，加入50 mg PSA吸附剂，涡旋混合2 min，4 000 r/min离心5 min。移取上清液至10 mL离心管中，氮气吹干，加入1 mL体积比为10∶90的甲醇-0.1%甲酸水溶液溶解残渣，用0.45 μm再生纤维素膜过滤至样品瓶中。

1.6基质标准曲线制备

以空白样品提取液作为标准溶液的稀释液，配置质量分数分别为1.0，2.5，5.0，10，20，50，100，200，300 μg/kg的基质标准曲线。以各组分进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制线性关系图，制作回归方程。以3倍和10倍信噪比（S/N）考察9种β2-受体激动剂的检出限（LOD）和定量限（LOQ）。

1.7方法回收率及检出限

称取阴性待测样品2 g，加入适量的混合标准溶液，配置成加标量分别为50，100和200 ng/g三个梯度的加标样品，依据优化的样品前处理方法和色谱条件进行测定，每个浓度平行测定6份样品，计算日内和日间回收率和相对标准偏差（RSD）。

2 结果与分析

2.1仪器条件优化

2.1.1 色谱条件优化

在分析本研究涉及的9种β2-受体激动剂时，研究人员多采用C18色谱柱进行分析[11-12]。因此本试验选用性能较好的Shim-pack XR-ODS(3.0 mmi.d×75 mm)色谱柱。流动相的使用对目标分析物的影响较大，相关研究中所用流动相多为水相和有机相的混合物，其中有机相为甲醇或乙腈，水相则为低浓度的甲酸水溶液，并执行梯度洗脱程序。本研究在确定色谱柱后对比了水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、水-0.1%甲酸甲醇、水-0.1%甲酸乙腈、0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇和0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈组成的流动相的分析效果。结果表明，0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈作为流动相时保留时间和分离效果相对较好，通过改变不同时间段水相和有机相比例，反复试验后确定最佳梯度洗脱条件为：0 ～1.5 min，流动相B的体积分数为90%；1.5 ～9 min，B由90%降至5%；9 ～11 min，B由5%升至90%；11.1 ～15 min，B为90%。

2.1.2 质谱条件优化

ESI+模式下分别对1 mg/L 9种β2-受体激动剂的标准溶液进行一级质谱扫描分析，得到每种成分的母离子，对其进行全扫描确定子离子。以MRM模式进行监测，优化每种β2-受体激动剂的母离子和子离子所需最佳碰撞能量（DP）和最佳锥孔电压（CE），得到优化的质谱参数如表1所示。

表1 9种β-受体激动剂的质谱优化条件

2.2提取条件优化

β2-受体激动剂属于强极性的化合物，含有胺类结构，部分还有1，2苯二酚（儿茶酚）等功能团［13］。该类药物的提取剂以甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯和二氯甲烷为主。由于液态乳中富含蛋白和脂质成分，且研究指出，乙腈具有良好的沉淀蛋白能力［14-15］，因此本研究以乙腈为提取剂进行试验。比较了三氯乙酸、乙酸、氨水和EDTA-Mcllvaine缓冲液对提取效果的影响，结果表明EDTA-Mcllvaine缓冲液和三氯乙酸可提高乙腈的提取效果（图1）。EDTA为金属离子配合剂，可竞争配合β2-受体激动剂母核结构中的金属离子，使目标化合物游离出来。三氯乙酸是熊林等人针对传统酶法提取β2-受体激动剂改进的水解方法，避免了酶解耗时长、提取效果不稳定以及回收率偏低等缺点[4]。将EDTA和三氯乙酸同时添加到乙腈中，可将提取效果提高大约10%左右（图2）。因此本研究用2 mL的EDTA、8 mL乙腈和1 mL三氯乙酸作为提取剂进行后续试验。

图1 不同物质对9种β2-受体激动剂回收率的影响

图2 EDTA-Mcllvaine和三氯乙酸对9种β2-受体激动剂回收率的影响

2.3脱水剂的优化

NaCl、MgSO4和Na2SO4是常用的脱水剂，液态乳中水分含量较高，因此分别用6 g NaCl，MgSO4，Na2SO4对上清液除水（图3）。结果表明，MgSO4作为脱水剂时回收率较低，这可能与目标物易与Mg2+形成螯合物有关。NaCl的效果最好，但提高用量后提取效果下降，其原因可能是部分目标物进入到水相中。

图3 脱水剂对9种β2-受体激动剂回收率的影响

2.4净化条件优化

液态乳经酸化乙腈和EDTA-Mcllvaine缓冲液提取后，已清除了蛋白质和大部分干扰物。为进一步提高净化效率，采用分散固相萃取法净化手段对样品进行处理。本研究选取C18，NH2，PSA比较其净化效果。结果表明，在相同用量下（100 mg），PSA作为净化剂的效果最好（图4）。三种填料均以硅胶为基质，分别键合C18、氨丙基和N-丙基乙二胺。PSA可有效去除提取液中的脂类和糖类物质，并且对β2-受体激动剂无显著吸附。液态乳中乳糖和乳脂肪含量较高，这可能是PSA具有较好净化作用的主要原因。

图4 净化剂对9种β2-受体激动剂药物回收率的影响

2.5基质标准曲线、线性范围和检出限及定量限

在质谱分析中，浸提物共流出组分对电喷雾离子化效果和检测信号有增强作用。为消除基质效应对β2-受体激动剂测定的影响，以经验证不含有9种β2-受体激动剂药物的空白液态乳提取液作为标准溶液的稀释液，采用优化后的前处理方法，制作基质加标工作曲线，得到线性回归方程的相关系数r2在0.991 ～0.998之间，线性范围为1.0～200 μg/kg。说明9种药物在该质量分数范围内线性关系良好。以定量离子信噪比（S/N）大于3为样品的检出限（LOD），以S/N大于10为定量限（LOQ），得到9种β2-受体激动剂的LOD为0.03 ～0.13 μg/kg，LOQ为0.1 ～0.4 μg/kg（见表2）。

2.6方法的回收率和精密度

采用标准添加法，在空白液态乳样品中分别添加3个水平的混合标准溶液进行回收率试验，每个添加水平依据本实验方法做6次平行测定，得到每个β-受体激动剂残留量的平均回收率为78.2～96.0%，相对标准偏差（RSD）为3.7～13.7%，符合兽药残留检测相关标准的要求。

3 结论

本文结合液态乳基质特性和β2-受体激动剂类兽药的理化性质，展开了QuEChERS–液相色谱法质谱法测定液态乳中9种β2-受体激动剂药残留的分析方法研究。对液态乳中9种β2-受体激动剂兽药残留的提取、盐析和净化过程中的各种影响因素进行了评价与优化，提高了提取方法效率。该方法前处理方法快速、简洁，定量方法准确，成本较低，能够满足对液态乳样品中β2-受体激动剂兽药残留的快速检测，也适用于大量筛查β-受体激动剂残留。

表2 9种β2-受体激动剂的线性方程、线性范围、相关系数（r2）、检出限（LOQ）和定量限（LOD）

表3 9种β2-受体激动剂的回收率和RSD

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Determination of 9β2-agonist drug residues by high performance liquid chro⁃matography-tandem mass spectrometry with QuEChERS in milk

LI Jing-yan,GUO Chun-feng,CUI Li-hui,LIU La-ping
（College of Food Science and Engineering，Northwest A&F University，Food Quality Supervision and Inspection Test⁃ing Center（Yangling），Ministry of Agriculture，Yangling 712100，China）

A method was developed for simultaneous determination ofβ2-agonist drug residues in milk by QuEChERS-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The milk was extracted with acetonitrile,EDTA-Mcllvaine and tri⁃chloroacetic,dehydrated with NaCl,purified with PSA sorbent and separated by Shim-pack XR-ODS(3.0mmi.d×75mm)column using acetonitrile and water(containing 0.1%formic acid)as mobile phase.The mass spectrometric acquisitions were carried out by means of multi⁃ple reaction monitoring(MRM)in positive ionization mode.The linear relation of 9β2-agonist drug was good and the correlation coeffi⁃cient was more than 0.991.The limit of detection(LOD)of 9β2-agonist drugs was 0.03～0.13 μg/kg and the limit of quantification(LOQ) was 0.1～0.4 μg/kg.The recovery rates of the target analyte were between 78.2%～96.0%.The relative standard deviations(RSD)were less than 13.7%.The method was reliable for the determination ofβ2-agonist drug inmilk.

milk;β2-agonist drug residues;QuEChERS;HPLC-MS/MS

TS252.7

A

1001-2230（2016）11-0049-04

2016-06-22

李婧妍（1980-）女，实验师，从事食品和农产品中农药和兽药残留检测工作。

刘拉平