感染T细胞斑点试验在耐多药肺结核诊断中的应用价值

胡钰卿潘爱珍王 静朱 敏▲

1.杭州市红十字会医院结核实验室 ，浙江杭州 310003；2.浙江省疾控中心结核病预防控制所结核实验室，浙江杭州 310051

感染T细胞斑点试验在耐多药肺结核诊断中的应用价值

胡钰卿1潘爱珍2王 静1朱 敏1▲

1.杭州市红十字会医院结核实验室 ，浙江杭州 310003；2.浙江省疾控中心结核病预防控制所结核实验室，浙江杭州 310051

目的分析探讨感染T细胞斑点试验（TSPOT.TB）在耐多药肺结核诊断中的应用价值。方法选择2014年1月～2016年1月我院收治的耐多药肺结核患者71例，另选择35例同期健康体检者作为对照组，比较各种检测方法诊断的敏感性，并采用特异性、准确度作为诊断试验的评价指标。结果T-SPOT.TB检测诊断耐多药肺结核敏感性最高，达95.6%，显著高于其他各项检测方法，差异具有显著性（P＜0.05）。抗酸杆菌涂片、结核菌培养、T-SPOT.TB检测用于诊断耐多药肺结核的敏感性较高，达90%以上。T-SPOT. TB检测用于诊断耐多药肺结核的特异度最高，达91.9%，显著高于其他各项检测方法，差异具有显著性（P＜0.05）。 T-SPOT.TB检测用于诊断耐多药肺结核的准确度最高，达96.2%，显著高于其他各项检测方法，差异具有显著性（P＜0.05）。结论与其他检查方法相比，感染T细胞斑点试验对诊断耐多药肺结核具有特异性高、准确度高的优点，值得广泛推广和应用。

耐多药肺结核；感染T细胞斑点试验

结核病是一种慢性传染病，是由结核分支杆菌感染引起的疾病，其中最为常见的是肺部结核。近年来全球结核病疫情呈回升状态，耐药结核菌发生率不断增加。其中，耐多药肺结核指结核菌至少同时对利福平、异烟肼两种抗结核药物耐药，发病率较高，约占全世界25.0%，还存在持续向外播散耐多药结核菌情况[1]。耐多药肺结核治疗难度大，治疗周期长，治愈率低，因此，寻找特异的检测方法，快速且准确诊断是结核病控制的关键问题，且对于监测结核病的发展及转归及临床治疗具有重要意义。结核菌素试验（purified protein derivative tuberculin，PPD）为诊断结核病的主要方法，但假敏感性较高[2]。结核感染T细胞斑点试验（TB infection of T cells spot test，TSPOT.TB）为一种新型的诊断方法，敏感性和特异性水平较高。本研究选取疑患结核病例，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2014年1月～2016年1月我院收治的耐多药肺结核患者71例，入选研究对象均知情同意，均排除合并严重心、脑、肝、肾、消化系统等疾病者。其中男38例，女33例；年龄22～67岁，平均（41.2±6.2）岁；病史0.5～3年，平均 （14.1±3.2）月。疾病类型：原发性肺结核 15例，继发性肺结核40例，血型播散型肺结核16例。另选择35例同期健康体检者作为对照组，其中男18例，女17例；年龄20～58岁，平均（42.3±5.4）岁。

1.2 检测方法

1.2.1 T-SPOT.TB试验 取枸橼酸钠抗凝的静脉血5mL，分离外周血单核细胞（PBMC） 放在包被IFN-7抗体的微孔板，加入结核分枝杆菌特异性抗原早期分泌靶向抗原（ESAT-6） 和培养基滤过蛋白（CFP-10）作为抗原，37℃温箱培养24h后，洗去抗原致敏效应T淋巴细胞，加入生物素标记的二抗，再经酶联显色，在细胞因子分泌的地方形成斑点，通过记录斑点数检测结核分枝杆菌特异抗原致敏的效应T淋巴细胞数量。采用上海复星科技有限公司提供的试剂盒。

1.2.2 结果判断 当空白对照孔内斑点数＜6时，任一实验孔斑点数减去空白孔斑点数≥6，结果即为阳性；若空白对照孔斑点数＞6，任一实验孔斑点数大于空白孔斑点数的两倍，结果也表示阳性[3]。

1.2.3 其他检查方法 （1）PPD试验。采用Mantoux法，取PPD 0.1mL（含5单位结核菌素）行前臂尺侧皮内试验，48～72h后观察结果。硬结直径≥10mm为TST阳性结果。（2）血清结核抗体检测。采用蛋白芯片阅读仪，结核分枝杆菌蛋白芯片试剂盒均为南京大渊生物技术公司提供，结核分枝杆菌蛋白芯片试剂盒检测结核杆菌三种特异性抗体， 即抗脂阿拉伯甘露糖（LAM）、16kDa 及38kDa抗体，如果任一抗体检测为阳性，结果则判为阳性。严格按照试剂盒说明书进行操作，整个检测过程不超过30min。（3）结核DNA检测。将痰液中提取DNA模板加入PCR反应管，按规定循环参数进行PCR反应。（4）其他。抗酸杆菌涂片与结核分枝杆菌培养，具体检测方法同中国防痨协会基础专业委员会主编《结核病诊断实验室检验规程》2006版。

1.3 评价指标

采用敏感性、特异性、准确度作为诊断试验的评价指标。（1）敏感度=真阳性例数／（真阳性例数+假阴性例数）×100%，（2）特异度=真阴性例数／（真阴性例数+假阳性例数） ×100%。

准确度=真阳性＋真阴性/（真阳性+真阴性＋假阳性＋假阴性）×100%。

1.4 统计学处理

数据处理采用SPSS20.0统计学软件进行处理和分析， 计数资料采用χ2检验，计量资料以（）的形式表示，组间比较分析采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 T-SPOT.TB检测与其他各项检测方法诊断耐多药肺结核的敏感性、特异性、准确度比较

表1结果显示，抗酸杆菌涂片、结核菌培养、T-SPOT.TB检测用于诊断耐多药肺结核的敏感性较高，达90%以上。T-SPOT.TB检测用于诊断耐多药肺结核的特异度最高，达91.9%，显著高于其他各项检测方法，差异具有统计学意义（P＜0.05）。且表2结果还证实，T-SPOT.TB检测用于诊断耐多药肺结核的准确度最高，达96.2%，显著高于其他各项检测方法，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各检测方法诊断耐多药肺结核的敏感性、特异性、准确度比较[%（n/n）]

2.2 T-SPOT.TB检测与其他各项检测方法诊断耐多药肺结核敏感性比较

表2结果显示，PPD、结核PCR、结核菌培养、T-SPOT.TB检测方法用于耐多药肺结核检测的敏感性显著高于对照组，组间比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。且表1数据分析显示，T-SPOT.TB检测诊断耐多药肺结核敏感性最高，达95.6%，显著高于其他各项检测方法，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

结核病是全球严重的公共卫生问题之一，据WHO估计，全球有约20亿人感染结核分枝杆菌，每年有约200万人死于结核[4]。我国是结核病高发国家之一，2000年全国结核病流行病学调查显示，全国受结核菌感染人数约5.5亿，其中传染性肺结核病患者150万人，每年因结核病死亡的人数达13万人。近年来结核病的发病率有上升趋势，且耐药趋势较严重。因此，如何及早发现疾病并快速精准的进行诊断成为临床研究的重点。

表2 T-SPOT.TB检测与其他各项检测方法诊断耐多药肺结核敏感性比较[n（%）]

结核菌素试验（TST）是临床常用于结核筛查的常用方法之一，但假阳性率高，且易受患者身体状况影响而影响结果。体外核酸扩增技术即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）自1989年法国学者Brissonneol等首先报道用于诊断结核病，为结核病的快速诊断开辟了新途径，但由于其假阳性率较高影响了结果的可靠性。结核抗体检测试验敏感度较差、对潜伏性肺结核的筛查意义不大、价格昂贵。TSPOT.TB技术通过计算斑点的数量推测出患者体内结核杆菌产生反应的效应T细胞是否存在[5-7]。T.SPOT实验结合酶联免疫斑点技术（即ELISPOT技术）与r-干扰素释放试验，通过检测受结核分枝杆菌抗原刺激而活化的效应T细胞来诊断结核感染[8-10]。结核感染后体内长期存在抗原特异性T细胞，当再次遇到抗原刺激时，能迅速活化增殖，释放r-干扰素[11-13]。实验中利用ESAT6和CFP10两种结核特异性抗原刺激外周血中结核特异性T淋巴细胞分泌 r-干扰素，并通过ELISPOT方法检测r-干扰素的释放水平，从而判断机体是否感染结核杆菌。对活动性结核分枝杆菌感染具有较高的敏感性[14-16]。且TSPOT.TB的检测价格便宜、简单易行[17-19]。将TSPOT.TB与PPD试验相比，TSPOT.TB属于体外试验，PPD 试验属于体内试验；PPD试验的结果受多重因素制约，其临床应用受到一定的局限性，在肺结核感染的高发地带为患者进行PPD 试验的假阳性呈不断增多的趋势[20-22]；本研究选择71例耐多药肺结核患者作为研究对象，另选择35例同期健康体检者作为对照组，比较各种检测方法诊断的敏感性，并采用特异性、准确度作为诊断试验的评价指标。结果证实，T-SPOT.TB检测诊断耐多药肺结核敏感性最高，达95.6%， T-SPOT.TB检测用于诊断耐多药肺结核的特异度最高，达91.9%， T-SPOT.TB检测用于诊断耐多药肺结核的准确度最高，达96.2%，显著高于其他各项检测方法，差异具有显著性（P＜0.05）。与张玉平等[23]报道观点相符，与其他检查方法相比，TSPOT.TB对诊断耐多药肺结核具有特异性高、准确度高的优点。

[1] 王立红，付秀华，张桂芝，等.结核感染T细胞斑点试验在结核病诊断中的应用价值[J]. 中国防痨杂志，2013，35（12）：992-996.

[2] 陈旭君，黄溢华，崔会芳，等.52例结核感染T细胞斑点试验与痰结核菌检测及CT诊断肺结核病的对比观察分析[J].中华肺部疾病杂志（电子版），2014，7（4）：8-10.

[3] Kobashi Y，Shimizu H，Ohue Y，et a1.Comparison of T-cell integer-on-gamma release assays for Mycobaeterium tuberculosis specific antigens in patient with active and latent tuberculosis[J].Lung，2010，188（4）：283-287.

[4] Sun L，Xiao J，Li HM，et aI.Evaluation of the tuberculin skin test and the whole·-blood interferon-assay for diagnosis of latent tuberculosis infection in children[J].Chin J Evid Based Pediatr，2010，5（3）：201-206.

[5] 余亚丽，刘红.T-SPOT.TB在肺结核诊断中的应用价值[J].中国实用医刊，2015，42（7）：123-124.

[6] Dai Y，Feng Y，Xu R，et a1.Evaluation of interferon—gamma release assays for the diagnosis of tuberculosis：An updated meta-analysis[J].Eur J Clin Mierobiol Infect Dis，2012，31（11）：3127-3137.

[7] 张瑛，孙亚蒙，徐欣晖，等.结核感染T细胞斑点试验在结核性疾病中的诊断价值[J/CD].中华临床医师杂志（电子版），2010，4（12）：2431-2434.

[8] 陶学芳，王建华.结核感染T细胞酶联免疫癍点试验在肺结核及肺外结核诊断中的价值[J].浙江预防医学，2012，24（11）：4-7.

[9] 孙海柏，张立，刘佳庆，等.结核分枝杆茵T细胞斑点实验在肺结核诊断中的应用[J].山东医药，2013，53（43）：75-77.

[10] 徐建辉，何燕武，陈海明. 38kD-lgG和TSPOT-TB联合检测在结核病诊断中的应用[J].浙江临床医学，2015，17（8）：1268-1269.

[11] Nicol MP，Davies MA，Wood K，et al.Comparison of TSPOT.TB assay and tuberculin skin test for the evaluation of young children at high risk for tuberculosis in s community setting[J].Pediatrics，2009，123（1）：38-43.

[12] Chee CB，Barkham TM，Khinmar KW，et al.Quantitative T-cell interferon-·gamma responses to Mycobacterium tuberculosis-specific anti-gens in active and latent tuberculosis[J].Eur J Clin Mtierobiol Infect Dis，2009，28（6）：667-670.

[13] 李明武，朱惠琼，刘永莉，等.T-SPOT.TB、TB-DNA、PPD、TB-DOT/TB-CK检测在结核病诊断中的临床价值[J].昆明医学院学报，2011，（8）：78-80.

[14] 荣兰香，马淑红，艾清，等.T-spot.TB试验与PPD试验对结核病患者诊断价值相关性比较[J].中国实验诊断学，2013，17（8）：1475-1476.

[15] 肖倩，黄旭峰.T-spot.TB试验快速检测结核杆菌感染的临床应用研究[J].实验与检验医学，2009，27（3）：272-274.

[16] 李林阳，陈林利，李琦.结核感染T细胞斑点试验对肺结核的临床诊断价值[J].中华肺部疾病杂志（电子版），2014，7（6）：32-33.

[17] 梁瑞霞，李鑫.结核感染T细胞斑点试验在结核诊断中的应用[J].中国实用医刊，2015，42（8）：24-28.

[18] 杨新婷，郭超，梁清涛，等.结核感染T细胞斑点试验检测对老年活动性肺结核的诊断价值[J].结核病与胸部肿瘤，2015，44（48）：240-280.

[19] 曾谊，冯枭，宋梅梅，等.酶联免疫斑点试验在菌阴肺结核诊断中的价值[J].中国防痨杂志，2012，34（2）：100-101.

[20] 陈忠南，谭云洪.T-SPOT.TB检测试剂盒在诊断老年结核病中的临床应用研究[J].实用预防科学，2012，19（12）：l865-l866.

[21] 乐军，梁莉，李苏辉.酶联免疫斑点试验快速诊断结核分枝杆菌感染的临床应用价值[J].中华检验医学杂志，2012，29（11）：1005-1008.

[22] 陶臻，曾娟.结核感染T细胞斑点试验在结核病诊断中的应用价值[J].临床肺科杂志，2012，17（9）：704-707.

[23] 张玉平，丁显平，张丽媛，等.T-SPOT.TB、痰涂片和TB-DNA 检测在肺结核诊断中的比较研究[J].成都医学院学报，2013，8（1）：49-51.

Application value of T.SPOT-TB test in the diagnosis of Multidrug Resistant Patients with Pulmonary Tuberculosis

HU Yuqing1PAN Aizhen2WANG Jing1ZHU Min1
1.Tuberculosis laboratory, Hangzhou Red Cross Hospital, Hangzhou 310003, China; 2.Tuberculosis Laboratory, Zhejiang Provincial Center for Disease Control and prevention, Hangzhou 310051, China

ObjectiveTo analyze and discuss the application value of T.SPOT-TB test in the diagnosis of Multidrug Resistant Patients with Pulmonary Tuberculosis.Methods71 multi-drug resistant patients with pulmonary tuberculosis in our hospital from January 2014 to January 2016 were selected,In addition, 35 healthy persons were selected as control group. The sensitivity of the various diagnostic methods was compared. Specificity and accuracy were used as the evaluation indexes of diagnostic tests.Resultsthe positive rate of T-SPOT.TB in the diagnosis of multi drug resistant pulmonary tuberculosis was the highest, reaching 95.6%, which was significantly higher than other detection methods, and the difference was significant(P＜ 0.05). The sensitivity of acid-fast bacilli sputum smear, culture of bacteria and T-SPOT.TB testing in the diagnosis of multi drug resistant pulmonary tuberculosis were high, reached more than 90%. The specificity of T-SPOT.TB detection for the diagnosis of multi drug resistant pulmonary tuberculosis was the highest, up to 91.9%, significantly higher than other detection methods, and the difference was significant(P＜ 0.05). The accuracy of T-SPOT.TB detection in the diagnosis of multi drug resistant pulmonary tuberculosis was the highest, up to 96.2%, significantly higher than other detection methods, and the difference was significant(P＜0.05).ConclusionCompared with other examination methods, T.SPOT-TB test has the advantages of high specificity and high accuracy in the diagnosis of multi drug resistant pulmonary tuberculosis. It is worth popularizing and applying. It is worth popularizing and applying.

Multi drug resistant pulmonary tuberculosis; T.SPOT-TB test

R446.1

B

2095-0616（2016）21-147-04

2016-09-10）

▲通讯作者