胶滴肿瘤药敏检测技术对膀胱灌注化疗药物选择的临床研究

王美才周荣升周祥举庞 昆▲韩从辉

1.江苏省沭阳县中心医院泌尿外科，江苏沭阳 223600；2.东南大学附属徐州市中心医院泌尿外科，江苏徐州 221000

胶滴肿瘤药敏检测技术对膀胱灌注化疗药物选择的临床研究

王美才1周荣升2周祥举2庞 昆2▲韩从辉2

1.江苏省沭阳县中心医院泌尿外科，江苏沭阳 223600；2.东南大学附属徐州市中心医院泌尿外科，江苏徐州 221000

目的研究胶滴肿瘤药敏检测技术对膀胱灌注化疗药物选择的作用。方法对145例行经尿道等离子电切的膀胱癌患者进行随访，根据是否采用肿瘤药敏检测分为两组，A组根据药敏检测技术采用吡柔比星、表柔比星、丝裂霉素或吉西他滨灌注化疗，B组不经药敏检测，根据经验仅采用吡柔比星灌注化疗。比较两组患者的年龄、性别、是否吸烟、肿瘤级别、肿瘤大小等基线资料；采用生存分析模型比较组间肿瘤复发率和复发时间。结果两组患者在年龄（P=0.2915）、性别（P=0.5268）、是否吸烟（P=0.8915）、肿瘤级别（P=0.1931）和肿瘤大小（P=0.1655）的差异无统计学意义；两组患者随访复发率比较有统计学差异（P=0.0298＜0.05）。生存分析结果：两组之间复发时间差异有统计学意义（χ2=6.663，P=0.0098＜0.05）。结论使用CD-DST法对体外原代膀胱尿路上皮癌细胞进行膀胱灌注化疗药物敏感度测定，可以有效选择敏感化疗药物，有效降低膀胱癌复发率，并有效推迟膀胱癌复发时间，为膀胱灌注化疗的个体化药物选择上，有重要意义。

膀胱灌注化疗；胶滴肿瘤药敏检测技术；药物选择；复发率；生存曲线分析

浅表性膀胱癌的治疗首选经尿道膀胱肿瘤电切除（TUR-Bt），但术后复发率较高，40%～70%的膀胱癌患者在术后1年内复发[1]。术后的膀胱灌注化疗成为预防膀胱癌复发的关键治疗措施。但是目前在膀胱灌注化疗药物的选择上，临床上具有盲目性和经验用药的随众性。目前国内文献报道的膀胱灌注化疗药物的选择方法有两种：基因选择法[2]和肿瘤药敏法[3]。其中，肿瘤药敏法作为一种较为经济、有效、方便的选择方法，得到临床医生的重视。徐州市中心医院自2012年起开始应用胶滴肿瘤药敏检测技术（CD-DST法）作为膀胱灌注化疗药物的选择依据；同时，部分患者未选择该法，并采用吡柔比星经验用药。我科对共计145例浅表性膀胱癌患者进行跟踪随访，研究CD-DST法对膀胱灌注化疗的指导作用。

表1 两组基线资料比较结果

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2012年7月～2014年7月在沭阳县中心医院泌尿外科和徐州市中心医院泌尿外科因膀胱癌行经尿道等离子电切术的145例患者进行跟踪随访。两组患者在年龄（P=0.2915）、性别（P=0.5268）、是否吸烟（P=0.8915）、肿瘤级别（P=0.1931）和肿瘤大小（P=0.1655）的差异无统计学意义，具有可比性（见表1）。根据是否行肿瘤药敏实验检测分为两组，A组药敏实验组，根据药敏检测技术采用吡柔比星、表柔比星、丝裂霉素或吉西他滨灌注化疗；B组非药敏实验组，不经药敏检测，根据经验仅采用吡柔比星灌注化疗，对随访结果进行比较，采用生存分析模型对复发率进行比较分析。注射用盐酸表柔比星（速溶）（辉瑞制药有限公司，H20000496）注射用盐酸吡柔比星（海正辉瑞制药有限公司，H20045983）丝裂霉素注射粉针（浙江海正药业股份有限公司，H33020786）注射用盐酸吉西他滨（江苏豪森药业股份有限公司，H20030105）。

1.2 CD-DST法

将新鲜的膀胱尿路上皮癌组织在无菌条件下将肿瘤组织剪碎，胶原酶消化，获得单细胞悬液。离心后接种于I型胶原蛋白包被的培养瓶中，培养出原代膀胱尿路上皮癌细胞；弃去未贴壁的死细胞，获得单细胞悬液。在冰浴的条件下，将I型胶原蛋白溶液、10×F12培养基和缓冲溶液按8：1：1体积比混合制成胶原蛋白混合溶液，将肿瘤细胞悬液加入胶原蛋白混合溶液，调整细胞浓度为1×105个/mL。在冰浴的条件下，将胶原蛋白-细胞混合溶液接种于6孔细胞培养板，形成胶滴后加入培养基培养。细胞培养板培养24h后，分别加入THP及 EPI，同时设阴性对照孔。药物作用下培养24h，洗去抗癌药物，加入培养基，继续 培养7d。并通过中性红染色固定干燥后，利用Scion Image分析系统通过倒置显微镜对胶滴中细胞的染色情况进行扫描，结果传输到计算机。通过图像软件，设定亮度值128为阈值，可以排除染色较浅的成纤维细胞，直接计算肿瘤细胞形成的克隆进行吸光度（A）值测定，计算出药物的抑制率。

1.3 膀胱灌注化疗

表柔比星采用50mg溶于40mL无菌5%葡萄糖溶液中经导尿管灌入膀胱，并嘱患者立位、左侧卧位、右侧卧位、仰卧位、俯卧位各持续12min，共计1小时后排空膀胱；吡柔比星采用30mg溶于40mL无菌生理盐水溶液中；吉西他滨采用1g溶于40mL无菌生理盐水溶液中；丝裂霉素20mg溶于40mL无菌生理盐水溶液中，后三者灌注、体位与保留时间均同表柔比星。

药敏实验组每位患者均术后即刻（8小时内）灌注吡柔比星1次，然后术后1周根据药敏结果进行灌注化疗，每周1次共计8次，然后每月1次满2年。非药敏实验组术后即可灌注吡柔比星1次，其余灌药时间同药敏实验组，但灌注药物均为吡柔比星。两组患者均每月进行膀胱彩超检查，可疑者进行膀胱镜检查，每3个月进行一次膀胱镜检查确定是否复发，随访期为2年，因2年未复发者无需膀胱灌注，失访率较高，随访2年后结果未纳入研究。

1.4 基线数据比较

比较两组患者的年龄、性别、是否吸烟；比较两组数据的肿瘤级别（低、中、高）、肿瘤大小（mm）。

1.5 结果比较

比较两组之间肿瘤复发概率和复发时间。

1.6 统计学方法

表3 两组不同时间累积治愈数与治愈率比较[n（%）]

2 结果

两组患者随访复发率比较有统计学差异有统计学意义（P=0.0298＜0.05，表2）。疗效分析，两组患者在不同治疗阶段复发状况见表3，生存曲线（治愈曲线）不交叉（图1），采用Log-Rank检验，两组间有统计学差异（χ2=6.663，P=0.0098＜0.05）。采用COX生存曲线分析模型将两组复发患者进行治愈曲线分析，差异有统计学意义，两组间比较结果见表4。采用药敏法选择敏感药物行膀胱灌注，会推迟肿瘤复发时间。

表2 两组复发率比较结果[n（%）]

表4 两组复发患者治愈曲线

3 讨论

膀胱癌是美国男性排名第四、女性排名第九的恶性肿瘤，在我国是排名第十的恶性肿瘤[4]。其中，膀胱尿路上皮癌占93.2%，分期Tis、T1、T2占88.6%[5]。术后复发率较高，40%～70%的膀胱癌患者在术后1年内复发[1]。行TUR-Bt的Tis及T1患者，三年复发率为45.2%，复发时间平均为（11.0±9.0）个月，三年生存率为T1以下93.4%，T2期72.2%[5]。

图1 两组患者累积治愈曲线

目前膀胱癌的治疗方式有很多，TUR-Bt仍然是Tis、T1、T2期手术的金标准，目前还有膀胱部分切除术[6]、钬激光膀胱肿瘤切除术[7]和绿激光膀胱肿瘤切除术[8]等。术后的膀胱灌注化疗成为预防膀胱癌复发的关键治疗措施。目前在膀胱灌注化疗药物的选择有很多[9-13]：（1）吡柔比星；（2）吉西他滨；（3）丝裂霉素；（4）表柔比星；（5）吉西他滨和吡柔比星交替膀胱灌注化疗；（6）其他联合灌注化疗。但目前膀胱灌注化疗的选择仍靠临床经验或某些研究成果，无统一标准，中国泌尿外科疾病诊断与治疗指南也未提供灌注药物的选择方法。以往我们一般膀胱癌术后灌注药物根据自己的经验或参考相关文献选择灌注药物，膀胱尿路上皮癌的术后复发率较高。复发后再次均选择经尿道肿瘤腔镜切除术（电切或激光），更换另外一种药物进行灌注，但是选择的药物具有随机性，因为不知道此患者对什么药物敏感。膀胱灌注化疗药物选择上具有盲目的、经验性、随机性。自从引入CD-DST后，手术中切除肿瘤送病理前常规留取部分肿瘤组织行肿瘤药敏实验，然后根据药敏实验结果选择最佳药物，明显降低肿瘤术后复发率、推迟肿瘤复发时间。

陈震[3]和肖振东等[14]早在2009年就对MTT法肿瘤药敏试验在膀胱灌注化疗药物的选择上做出研究，初步证实了肿瘤药敏实验在膀胱灌注化疗药物选择中起到的重要作用。徐州市中心医院病理科采用新式肿瘤药敏检测方法，即CD-DST法应用于临床，指导膀胱灌注化疗用药。本研究中，使用肿瘤药敏实验来选择膀胱灌注化疗的药物，可以明显降低膀胱癌复发率，并可以推迟中位复发时间。

CD-DST体外肿瘤药敏检测技术是一种较好的药敏检测方法，其所需标本量较小，约1mm3即可，不会影响常规病理标本的留取，弥补了目前其他药敏技术的不足[15]。而且原代培养成功率高、能够排除成纤维细胞对实验的干扰，在体外对抗癌药物的特异性杀伤作用做出客观评价。CD-DST体外肿瘤药敏检测技术可反映患者对不同抗肿瘤药物敏感性的差异，检测结果与临床经验有效率有较好的符合性，对抗肿瘤药物的体外筛选和对个体化治疗具有较高的实用性意义。

本研究表明，使用CD-DST法肿瘤药敏检测技术对体外原代膀胱尿路上皮癌细胞进行膀胱灌注化疗药物敏感度测定，可以有效选择敏感化疗药物，有效降低膀胱癌复发率，并有效推迟膀胱癌复发时间，为膀胱灌注化疗的个体化药物选择上，有重要意义。

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Clinical study of collagen gel droplet culture-drug sensitivity test for choosing intravesical chemotherapy of bladder cancer

WANG Meicai1ZHOU Rongsheng2ZHOU Xiangju2PANG Kun2HAN Conghui2
1.Department of Urology,Shuyang County Central Hospital,Shuyang 223600,China;2.Department of Urology,Xuzhou Central Hospital,Xuzhou 221000，China

ObjectiveTo study the collagen gel droplet culture-drug sensitivity test （CD-DST） for choosing intravesical chemotherapy of bladder cancer.MethodsAccording to the drug susceptibility testing technology,145 transurethral bladder cancer patients were divided into two groups.Group A used topiramate,doxorubicin,epirubici n, mitomycin,or gemcitabine chemotherapy and Group B used topiramate or doxorubicin without drug susceptibility testing.Comparing the basic data of patients,such as age,sex,smoking,tumor grade and tumor size.Tumor recurrence and recurrence interval can be found by using cox survival curve model.ResultsThere were not significant differences in age（P=0.2915）, sex（P=0.5268）, smoking（P=0.8915）,tumor grade（P=0.1931）,and tumor size（P=0.1655）,while it was statistically significant （P=0.0298＜0.05） in terms of relapse rate.The use of the drug susceptibility method to select sensitive bladder perfusion,would delay tumor recurrence （χ2=6.663,P=0.0098＜0.05）.ConclusionCDDST method of primary urothelial bladder cancer infusion chemotherapy sensitivity assay can effectively choose the sensitive chemotherapy drugs to effectively reduce the recurrence rate of bladder cancer in vitro.It is important to postpone the time of bladder cancer recurrence and effectively to choose intravesical individualized chemotherapy.

Intravesical chemotherapy;The collagen gel droplet culture-drug sensitivity test （CD-DST）;Drug selection;Recurrence rate;Cox survival curve model

R737.33

B

2095-0616（2016）21-80-04

2016-09-12）

江苏省重点研发计划（BE2015623）；江苏省“科教兴卫”工程医学重点人才科研项目（RC2011046）。

▲通讯作者