二陈加桃红四物汤改善类风湿关节炎的机理研究＊

王腾腾，赵永见，陈 岩，李金龙，王拥军，施 杞，梁倩倩，徐 浩＊＊

（1.上海中医药大学附属龙华医院 上海 200032；2.上海中医药大学脊柱病研究所 上海 200032）

二陈加桃红四物汤改善类风湿关节炎的机理研究＊

王腾腾1，2，赵永见1，2，陈 岩1，2，李金龙1，2，王拥军1，2，施 杞1，2，梁倩倩1，2，徐 浩1，2＊＊

（1.上海中医药大学附属龙华医院 上海 200032；2.上海中医药大学脊柱病研究所 上海 200032）

目的：类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种累及全身小关节的自身免疫性疾病。前期研究发现，充足的淋巴回流功能有利于RA的恢复。本文主要探讨二陈加桃红四物汤治疗本病的疗效及其对淋巴管回流功能的影响。方法：本研究采用10周龄TNF转基因（TNF-Tg）小鼠为模型，以二陈加桃红四物汤灌胃治疗12周，并选取同窝野生型小鼠作对照，采用Micro-CT观测小鼠的踝关节骨量，采用近红外-吲哚菁绿系统检测小鼠下肢淋巴管功能。结果：Micro-CT三维成像显示，与对照组相比，TNF-Tg组可见明显的骨质破坏，踝关节结构严重受损。二陈加桃红四物汤治疗后，骨结构得到了一定程度的保护。淋巴管回流功能检测显示，与对照组相比，TNF-Tg组的淋巴管清除率明显下降；与TNF-Tg组相比，二陈加四物汤可促使受损的淋巴功能恢复。与对照组小鼠相比，TNF-Tg组的Pulse值明显下降，与TNF-Tg组相比，二陈加桃红四物汤可促进Pulse值明显升高。结论：二陈加桃红四物汤可以有效促进TNF转基因小鼠模型下肢的淋巴回流功能，从而缓解关节炎症，保护骨组织免受侵蚀。

类风湿关节炎 二陈加桃红四物汤 TNF转基因小鼠 淋巴回流功能

RA是一种自身免疫性疾病，多种炎性因子介导了该病的炎症反应；替代医学疗法在治疗RA方面具有较大的发展空间[1]。中医认为，痰瘀既是RA的病理产物，又是其基本病机[3]，二陈加四物汤为治疗痰瘀互结的常用方剂。现代研究认为，淋巴管回流功能在RA的发病过程中起到重要的作用[4]；TNF转基因（TNF-Tg）小鼠在阐释炎症反应中发挥了重要作用[2]，是研究RA常用的动物模型。本文主要探讨二陈加四物汤对TNF-Tg模型小鼠淋巴管回流功能的影响以及对RA的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验采用的TNF-Tg小鼠（line 3647）来自1991年George Kollias实验室，并由罗彻斯特大学赠送。TNF-Tg小鼠携带单人TNF拷贝基因，呈现自发慢性、进展性关节炎，与WT同窝对照小鼠一起饲养于上海模式动物中心，SPF级，自由饮水摄食。

1.2 实验试剂

组织提取与DNA抽提（美国Sigma公司，货号：051M8617V、SLBB1424V、041M6349），琼脂糖（西班牙Biowest公司，批号：G-10111860），DNA Marker（北京TIANGEN公司，货号：MD102），引物购自上海百力格生物技术有限公司。二陈加桃红四物汤组成：半夏12 g、橘红12 g、茯苓9 g、熟地12 g、当归12 g、白芍9 g、川芎9 g、桃仁9 g、红花6 g、炙甘草6 g，以上所有中药均购自上海中医药大学附属龙华医院中药房。异氟烷（深圳沃瑞德公司，批号：217140901），脱毛膏（印度利洁时公司，国妆特进字J20130140）。吲哚菁绿（Indocyanine Green，ICG）（美国Acorn公司，批号：081424）。近红外成像系统（法国Hubtech公司，型号：Fluobeam Clinical System）。小动物麻醉机（美国VMR公司，型号：V1315267），Micro-CT（瑞士SCANCO公司，型号：uCT80）。

1.3 实验方法

1.3.1 动物鉴定及分组

对3周龄小鼠剪尾，进行基因组DNA抽提。每个样本加入提取液25.00 μL，制备液6.25 μL，25℃ 5 min→ 95℃ 10 min→ 25℃ 5 min，加入25.00 μL中和液混匀，室温放置5 min。引物序 列F：5’-TACCCCCTCCTTCAGACACC-3’；R：5’-GCCCTTCATAATATCCCCCA-3’。PCR反应体系20 μL：Bioteke PCR mix 7 μL、水10 μL、DNA抽提产物1 μL、上下游引物各1 μL。94℃ 3 min、94℃30 s→60℃ 35 s→72℃ 1.5 min，30个循环，72℃7 min，4℃保存。配制2%的琼脂糖胶，上样量10 μL，电压110 V，持续40 min。阳性条带在200-300 bp之间。

采用SPSS软件将阳性小鼠按体质量随机区组，分为TNF-tg组、中药二陈加四物汤组（简称：中药ECSWT组），每组10只。按照阳性小鼠平均体质量，挑选体质量相似、同窝饲养的阴性小鼠10只，为对照组。

1.3.2 动物给药

根据《实验动物药理学》，将小鼠（20 g）与人（60 kg）的中药计量进行换算（换算系数9.01），小鼠需服中药煎剂浓度为1.09 g·mL-1，取上述中药1付，加12倍水，浸泡30 min，煮沸后再煎30 min，趁热过滤得煎液1；所余药渣加8倍水，同样方法得煎液2；合并两次煎液，通风橱中加热浓缩至67 mL，每只小鼠灌胃0.2 mL。对照组和TNF-Tg组灌胃生理盐水，每天1次，连续12周。

1.3.3 测量指标

小鼠气体麻醉，下肢脱毛，采用30号针头，10 μL ICG（0.1 μg·mL-1，蒸馏水溶解）注射小鼠足底皮肤，在近红外下连续可观察到荧光信号由集合淋巴管进入腘窝淋巴结，连续1 h并拍照，24 h后观察5 min。采用Image J软件定量测定图片中ICG的信号强度。根据两个时间点的足底信号强度可得出淋巴管的清除率，公式：清除率=（S24h-S1h）/S1h×100%。ICG注射1 h之后，淋巴管的信号趋于稳定，连续观测500 s淋巴管搏动情况，记录Pulse值[5]。灌胃前与灌胃结束后各采集一次指标。

动物踝关节取材，置于75%酒精固定24 h；采用Micro-CT扫描，参数为：电压55 kV、电流72 μA、分辨率10 μmpx。

1.4 统计方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。统计结果用平均值±标准差描述，多组间比较均用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05认为差异有统计学显著性意义。

2 结果

2.1 踝关节Micro-CT 3D成像

与WT小鼠相比，TNF-Tg组小鼠可见明显的骨质破坏，踝关节结构严重受损，骨量降低；与TNF-Tg组相比，ECSWT组小鼠骨结构受损得到了一定程度的缓解，骨量亦有所提高（图1）。

图1 不同组别小鼠踝关节Micro-CT 3D图像

2.2 淋巴管清除率检测

如图2、图3所示，蓝色圆圈部分为足底部注射部位，注射后24 h，与对照组（清除率76.10%）相比，TNF-Tg组的淋巴管清除率明显下降（清除率47.15%，P＜0.05）。与TNF-Tg组相比，ECSWT组清除率明显增加（清除率80.16%，P＜0.05），促进了受损淋巴功能的恢复。

2.3 淋巴管Pulse检测

图4所示为ICG注射1 h后500 s内淋巴管的信号强度变化情况，我们把峰值与谷值的变化次数转化为Pulse个数。如图5所示，对照组小鼠Pulse为每分钟1.45e个信号强度，与之相比，TNF-Tg组明显下降（每分钟0.62e个信号强度，P＜0.05）。与TNF-Tg组相比，ECSWT组Pulse信号强度升高（每分钟1.24e个信号强度，P＜0.05）。

图2 不同组别小鼠ICG-NIR成像

图3 不同组别小鼠下肢淋巴管清除率计量分析

图4 不同组别小鼠下肢淋巴管信号强度情况

图5 不同组别小鼠下肢淋巴管Pulse统计分析

3 讨论

RA以关节肿胀、疼痛、畸形为主要临床表现，若治疗不当，会导致全身多器官的的并发症。“尪”义为骨骼弯曲，本病在中医属于“尪痹”范畴；痰瘀在本病的病机、诊治中占有很大的比例，风寒湿邪侵袭经络，气血阻滞，痰瘀胶着，遂成此证[6]。本病主要病理表现为多种炎性因子浸润、滑膜细胞增生、血管翳的生成等[7]，与“痰瘀”的病机极为类似。“痰瘀”的中医理论基础实为“津血同源”，因此痰瘀同治的治疗方法有着深厚的理论基础和很长的发展历程。

二陈汤出自《太平惠民和剂局方》，主治“治痰饮为患”。《重楼玉钥》有二陈汤可治“骨槽风等症”的记载。目前二陈汤主要治疗肋骨骨折并发症[8]、坐骨滑膜囊肿[9]等病。桃红四物汤，又名加味四物汤，出自《玉机微义·卷三十一》（引《医垒元戎》），“桃红四物”之名首见于《医宗金鉴·卷四十四》，《正骨心法要旨》中用本方治疗跌打损伤下法之后痛不止。现代研究证明，桃红四物汤具有舒张血管、保护血管内皮[10]、治疗骨关节炎[11]，促进成骨分化[12]、调节免疫功能[13]等作用。由此可见，以上两方在骨病的临床、基础研究中均有应用，两方相合而成二陈加桃红四物汤，为痰瘀同治的经典搭配，可用于治疗酒精性脂肪肝、甲亢、卵巢囊肿等多种疾病的痰瘀阻滞型[14-16]。

前期研究证明，RA患者的关节滑膜中存在大量炎性因子的浸润，而淋巴管在关节的透明质酸、炎性因子、代谢产物等大分子[17]的回流中起到了重要作用。TNF-Tg小鼠的淋巴回流收到破坏，本研究通过二陈加桃红四物汤治疗TNF-Tg小鼠，证明该方可促进淋巴管回流功能的恢复，促进炎性产物的代谢，从而缓解关节骨的破坏，治疗RA。

血管在RA的作用越来越受到重视，大量研究发现，RA患者存在微循环障碍，心血管事件增加[18]等情况。此外，淋巴管在肿瘤转移、水肿、过敏性疾病、代谢性疾病等领域发挥着重要的作用[19]，淋巴管在RA的作用也应得到同样的关注。淋巴管在RA的研究才刚刚起步，尚有大量内容有待探索和发现。淋巴管与炎症、免疫关系密切，随着免疫医学的兴起，淋巴管必将受到越来越多的关注。中医素有“久病入络”和“顽痹生痰”[20]之说，王清任亦提出“瘀血致痹”，痰瘀致病、病程缠绵、反复发作，与慢性、难治性RA等疾病相似。传统的诊断技术、外科手术治疗均忽略了淋巴管，淋巴管有可能是影响多种疾病愈后的关键所在。临床中较棘手的并发症或难治性疾病，包括对生物制剂无应答者，都有可能在淋巴管上找到突破点。中医药如何在淋巴管研究潮流中发挥自己的独特优势，是值得我们深思的问题和未来的研究方向。

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Mechanisms Behind the Therapeutic Effects of Er Chen Combined with Tao Hong Si Wu Tang (ECSWT) on Rheumatoid Arthritis

Wang Tengteng1,2, Zhao Yongjian1,2, Chen Yan1,2, Li Jinlong1,2, Wang Yongjun1,2, Shi Qi1,2, Liang Qianqian1,2, Xu Hao1,2
(1. Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China; 2. Institute of Spine Diseases, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China)

Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic autoimmune disorder primarily occurred in small joints. Our previous studies suggested that sufficient lymphatic drainage was favorable for the recovery of RA. This study aimed at exploring the effect of Er Chen combined with Tao Hong Si Wu Tang (ECSWT) on RA in TNF transgenic (TNF-Tg) mice. Ten-week old TNF-Tg mice and WT littermates were detected with indocyanine green-nearinfrared (ICG-NIR) lymphatic imaging system before and after accepting the 12-week intragastric administration of ECSWT. All ankle joints were assessed by micro-CT scanning. According to three dimensional images of Micro-CT, it was found that the ankle joints in the TNF-Tg group were much eroded compared with the control group. The bone mass and structure were protected after the treatment of ECSWT. ICG-NIR results showed that lymphatic clearance rate of the TNF-Tg group decreased compared with those of the control group. In comparison with the TNF-Tg group, ECSWT promoted the repair of lymphatic function. Compared with the control group, the pulse value of the TNF-Tg group declined; while this condition could be rescued by ERSWT. In conclusion, ECSWT mitigated bone erosion of astragalus bone area in TNF-Tg mice in contrast to the saline mice, while promoted the pulse value and clearance of lymphatic vessels afferent from footpad to popliteal lymph node, implying that ECSWT was a promising agent for treating RA through its promoting lymphatic drainage function effects.

Rheumatoid arthritis, TNF-Tg mice, Er Chen Combined Tao Hong Si Wu Tang, lymphatic drainage function

10.11842/wst.2016.11.007

R274

A

（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）

2016-11-04

修回日期：2016-11-04

＊ 国家自然科学基金委重点项目（81330085）：痰瘀型类风湿性关节炎与淋巴关系的基础研究，负责人：施杞；国家自然科学基金委重大国际合作项目（81220108027）：益气祛湿法调控淋巴系统对炎症性关节炎的影响，负责人：王拥军；教育部高等学校全国优秀博士学位论文作者专项资金资助项目（201276）：负责人：梁倩倩；上海市龙华医院龙医创新团队（LYCX-01）：祛瘀化瘀防治颈痛和炎性关节炎的基础研究，负责人：梁倩倩；上海市卫生与计划生育委员会中医药三年行动计划项目（ZY3-CCCX-2-1002）：国家中医临床研究基地建设项目，负责人：崔学军；筋骨理论与治法教育部重点实验室，负责人：王拥军；上海市长宁区卫生与计划生育委员会"光华卓越PI工程"项目（2016-01），负责人：施杞；上海市教育委员会高校实验技术队伍建设计划（LH01.24.001）：负责人：赵永见。

＊＊ 通讯作者：徐浩，助理研究员，主要研究方向：中医药治疗关节炎症性疾病的疗效及机制研究。