循环肿瘤细胞检测在膀胱癌中的应用

严勇 孙洵 王剑松

·综述·

循环肿瘤细胞检测在膀胱癌中的应用

严勇 孙洵 王剑松

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，其发病率在全球恶性肿瘤中居第九位[1]，在我国泌尿系统肿瘤中发病率及死亡率均居首位[2]。膀胱癌多数以浸润方式生长，首次治疗后复发率高，约50%～70%，但目前仍无确切的可应用于临床的血清标志物来监测膀胱癌的复发、进展与转移，而应用影像学检查并不能早期发现微小转移灶，因此近50%的肌层浸润性膀胱癌在临床确诊时已有微转移灶[3]。基于此，临床急需一种能早期发现微转移灶的检测方法，以期早期发现膀胱癌的复发与转移，并据此制定有针对性的个体化治疗方案，从而降低膀胱癌的复发率，改善治疗效果及提高患者生存率。

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTC)是由肿瘤原发灶或转移灶释放进入外周血的肿瘤细胞，大多数被机体清除，少数存活，与原发肿瘤具有类似的抗原、遗传性，是肿瘤血行转移的基础。对比于影像学检查，CTC数量的改变明显早于影像学检查的改变[4]，因此可应用于膀胱癌早期微转移灶的监控和检测，并有望为膀胱癌的诊断、分期、治疗提供重要依据。本文结合近年的文献，就CTC检测及其在膀胱癌中的应用情况进行综述。

一、CTC的分型

CTC是痕量存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶脱落，大部分CTC进入外周血后被吞噬或凋亡，存活的CTC仅占外周血白细胞的1/106～107[5]，这些CTC在恶性肿瘤血行转移中起关键作用[6]。肿瘤细胞的侵袭性和上皮细胞间质转化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)有关，即发生了上皮细胞转化为间质，因此，CTC分为上皮型CTC、混合型CTC和间质型CTC。上皮型CTC通过自身分泌的基质金属蛋白酶使得迁移能力增强，转化为间质型CTC，从而播散、迁移能力更强[7]，间质型CTC主要是肿瘤细胞通过修饰自身形态及骨架结构、黏附分子，使黏附能力下降、可塑性增强，易于脱落。最终，间质型CTC具有更强的转移潜能[8]。据此，可通过分型检测CTC不同表型来判断肿瘤细胞侵袭能力，从而确定肿瘤进展、转移可能性;而原发部位肿瘤细胞与CTC的基因表达谱又不同,因此，今后还可以检测CTC的基因表达谱，以确定肿瘤的原发部位或转移部位，对肿瘤诊断及个体化治疗具有重要意义。

二、CTC的检测

从外周采集血液取材方便、侵袭性小，采集血液后浓缩聚集含有极少数CTC的血细胞，检测出CTC并与其他细胞鉴别，最后确定CTC分子特征，即完成了CTC的检测。目前CTC常用的检测方法分为富集、分选类和鉴别、分析类等。富集、分选类是利用细胞的理化特性将其特异性富集，以提高检测的敏感性，其中包括基于细胞密度的梯度离心法、基于细胞大小的膜滤过法等，梯度离心法利用CTC与白细胞的密度、沉降系数不同，进行梯度离心法分离，相比于基于上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)抗体的免疫磁珠分离法，得到的CTC中含有EpCAM阳性细胞和阴性细胞，因此，EpCAM阴性细胞没有遗漏，但灵敏度及特异性稍低[9]；基于细胞大小的膜滤过法是利用CTC直径显著大于白细胞，通过聚碳酸酯膜将CTC与血细胞分离，即使肿瘤表面标志物改变也能检出，其灵敏度高，在前列腺癌、乳腺癌患者中，本法CTC的检出率较CellSearch系统要高[10]，且能检测出CellSearch系统无法检测的CTC细胞团形成的微栓子，检出的CTC能应用于细胞培养、基因检测等。但基于细胞大小的膜滤过法不适于体积小或具有异质性的肿瘤细胞检测[11]。鉴别、分析类是利用肿瘤细胞表面标志物、基因转录水平来检测出CTC，包括流式细胞术、CTC芯片技术、RT-PCR及CellSearch 系统等，其中CellSearch 系统是目前唯一通过美国食品药品管理局(FDA)认证可用于临床的CTC检测方法，主要是应用包被了EpCAM抗体的免疫磁珠来检测出CTC，但在一些肿瘤细胞发生了EMT时会丢失抗原，发生漏检，且其价格昂贵，临床较难普及；流式细胞术是应用荧光标记相应抗体检测CTC，其操作简便、快速、数据准确，特异性高、可重复性好，费用低，可应用于临床普查，但敏感度低，其检测出的细胞不能进行后期的细胞培养、基因检测等；CTC芯片技术简便可行，是基于微流体学的检测技术，在芯片上预置包被EpCAM抗体的显微位点来检测CTC，并且能捕获到CTC 细胞团，总体捕获率可达95%～99%[12]，适于推广；RT-PCR具有较高的假阳性率，应用较少。综合上述检测方法，各有优缺点，因此，选择两种或多种技术联合应用可以明显提高CTC检测的特异性和敏感性。CanPatrol富集技术即是结合了免疫磁珠法和膜滤过法来检测CTC，其不需要依赖特异性抗体，白细胞去除率为99.9%，肿瘤细胞回收率>80%[13]，且能收集到各种表型的CTC及CTC细胞团，收集的CTC细胞还能用于细胞培养、免疫荧光剂基因检测等，值得临床推广。而目前关于检测膀胱癌患者CTC的报道较少，其中，国外多采用CellSearch系统，国内多采用免疫芯片分选法等，依据其自身检测原理均能检测出CTC，且阳性率均不低，提示膀胱癌患者也能较好地应用CTC检测来监测疾病进展、复发及转移情况。

三、CTC检测在临床膀胱癌中的应用

目前，有较多关于CTC检测与多种肿瘤包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌等的复发和转移关系紧密的报道，提示CTC检测对其诊断、分期、治疗均能提供重要依据[14-16]。但CTC检测在临床膀胱癌中的应用报道相对较少。

1.膀胱癌的诊断和分期：膀胱癌微转移灶的早期诊断和干预对患者的预后极为重要，虽然目前有血清学的肿瘤标志物和高分辨率的影像学检查，但因缺乏特异性的血清标志物及显微影像学观察，仍无法做到早期发现微转移灶及对疾病的精准监测。而目前膀胱癌的CTC检测，一般为采集病理确诊的患者外周静脉血送检，因外周血CTC数目极少，浓集后每1×106～1×109个正常细胞才能检测出一个CTC，因此，一个及以上的CTC检出即视为进入循环的膀胱癌细胞，视为阳性。有研究表明，曾有临床≤Ⅱ期的膀胱癌患者，治疗前检测出CTC，治疗后确定为Ⅲ期，甚至Ⅳ期，提示术前临床分期过低，因此，CTC的检测不仅能作为膀胱癌的诊断依据之一，还能作为非肌层浸润性膀胱癌与肌层浸润性膀胱癌的重要鉴别指标[17]。而另一项研究指出，术前CTC的检出以及CTC数量的多少与根治术后膀胱癌的病理分期无明显相关性[18]。目前的研究表明，CTC与膀胱癌的TNM分期有一定关联，特别是与T分期具有相关性[19]，但未发现与N及M分期的相关性[20]，因此，目前CTC检测还不能作为膀胱癌分期的指南性指标，仅能作为分期的参考，CTC的检出不是直接预示了肿瘤的高分期，而仅是提示了高危膀胱癌，高复发、高转移率，从而对治疗提供积极的指导意见。

2.膀胱癌的治疗及疗效监测：虽然不断有细胞角蛋白等新的肿瘤细胞表面标志物的出现，但目前仍无一种特异性的膀胱癌血清标志物应用于临床，因此，膀胱癌的治疗仍陷于程序化，缺乏个体化的治疗，缺乏关键的关于肿瘤复发、转移的治疗反馈和疗效监测手段。而已有大宗的前瞻性研究表明，膀胱癌治疗后即使是仅有一个CTC的检出，均标志着肿瘤复发率、癌症相关病死率高以及总生存率低，预后较差[21]。因此，CTC的检测可预期对于临床膀胱癌的治疗具有极好的指导意义。现有的各种检测方法均是检测出一个及以上的CTC即为阳性，但鉴于不同检测方法敏感性及特异性不一致，目前倾向于联合应用多种技术检测，最终达到统一的、标准化的检测方法。对于局限性膀胱癌而CTC阳性的患者通过局部治疗往往不足以达到根治的目的，可密切随访，或应用辅助化疗或新辅助化疗；对于CTC数量多或多发间质型CTC或CTC细胞团的患者，结合分期，倾向于根治术结合辅助化疗，从而减少复发、转移，使患者在总生存率及无病生存率方面获益。另一方面，由于指南认为膀胱癌根治术有最佳治愈可能，临床上有不少患者处于过度治疗，而通过CTC的筛查、监测，有望对治疗进行实时指导，减少膀胱切除率，提高患者生活质量，而不影响患者的总体生存率。对于CTC数量、表型的变化和表面生物学分子的分析，有利于治疗疗效的评价及指导个体化靶向治疗；对于CTC的基因表达及突变情况的实时检测，能判断肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性，从而及时调整药物，监测、提高疗效。

3.膀胱癌的预后：膀胱癌的预后与肿瘤的进展和转移关系密切，Rink等[22]在50例局限性膀胱癌患者外周血中检测出CTC阳性15例(30%)，对CTC阳性和CTC阴性患者进行统计学分析发现，二者在总体生存率、无进展生存率和癌特异性生存率方面差异均有统计学意义，CTC阳性患者进展、转移率高，预后差。随后又应用CellSearch系统进一步研究了100例局限性膀胱癌患者，术前CTC阳性率为23%，随访发现CTC阳性患者具有更高的复发率，多因素分析显示CTC为肿瘤复发和特异生存的独立预测指标[21]。因此，CTC检测对于评估膀胱癌的预后有一定意义。

四、展望

目前，CTC的分离和鉴定技术在不断完善，特别是联合应用多种技术取得了较好的效果，但临床应用仍需要经过多中心验证，进而标准化；而目前CTC检测在膀胱癌诊治、预后判断方面样本量尚小，也需要后续的大规模临床研究及长期的跟踪随访评估。相信随着CTC检测方法的完善、标准化，以及更敏感、更特异的CTC相关标志物的出现，将逐渐建立起CTC标准化的检测方案和以其为基础的膀胱癌诊治、疗效和预后评价标准，形成个性化治疗方案体系。

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(本文编辑：熊钰芬)

昆明市科技局基金项目(2015-2-S-01577)

650011 昆明市第一人民医院 昆明医科大学附属甘美医院泌尿外科(严勇、孙洵)；昆明医科大学第二附属医院泌尿外科(王剑松)

严勇，E-mail：yyx079@163.com

10.3870/j.issn.1674-4624.2016.05.016

2016-10-10)