氯化汞对斑马鱼发育的毒性作用及对轴突蛋白2a基因表达的影响

樊成吉*，屠鸿薇*，陈小辉，柳家贤，彭 涛，孟晓静

（南方医科大学1.公共卫生学院职业卫生与职业医学系，广东省热带病研究重点实验室，2.生命科学学院发育生物学系，广东省人类疾病斑马鱼模型与药物筛选重点实验室，广东广州 510515）

氯化汞对斑马鱼发育的毒性作用及对轴突蛋白2a基因表达的影响

樊成吉1*，屠鸿薇1*，陈小辉2，柳家贤1，彭 涛1，孟晓静1

（南方医科大学1.公共卫生学院职业卫生与职业医学系，广东省热带病研究重点实验室，2.生命科学学院发育生物学系，广东省人类疾病斑马鱼模型与药物筛选重点实验室，广东广州 510515）

目的 观察氯化汞（HgCl2）暴露对斑马鱼胚胎发育时期的毒性作用，以及对神经行为和轴突蛋白（nrxn）2a基因表达的影响。方法 将斑马鱼胚胎在受精后6 h内（6 hpf）暴露在HgCl20.2，0.4和0.8 μmol·L-1中，在24 ～120 hpf时观察HgCl2对斑马鱼死亡率、孵化率和畸形率的影响；用电感耦合等离子体质谱测定体内Hg含量；用Video-Track系统记录斑马鱼幼鱼的行为改变；用吖啶橙染色检测细胞凋亡；用原位杂交和实时定量PCR检测其对nrxn2a基因表达的影响。结果 与正常对照组相比，HgCl20.8 μmol·L-1处理组72 hpf时，斑马鱼的死亡率开始显著升高，在120 hpf时死亡率达到94%（P<0.01）；HgCl20.4 μmol·L-1处理组48 hpf时，斑马鱼的孵化率显著上升（P<0.01）；HgCl20.2，0.4和0.8 μmol·L-1组斑马鱼的胚胎发育畸形，主要表现为脊柱弯曲和卵黄囊肿，各个时间点和浓度组的畸形率显著高于正常对照组（P<0.05，P<0.01）。各处理组斑马鱼体内Hg与正常对照组相比蓄积明显（P<0.01），HgCl20.8 μmol·L-1处理组达到77 μg·g-1。与正常对照组相比，HgCl20.4 μmol·L-1暴露组斑马鱼自发活动的速度减缓（P<0.01），活动程度降低（P<0.05）；凋亡点的数量也出现显著性增加（P<0.01）。斑马鱼胚胎中nrxn2aamRNA表达在受精后24 hpf（P<0.01）和72 hpf（P<0.05）两个时间点呈显著性增加，而nrxn2abmRNA表达在24和48 hpf两个时间点呈显著性下降（P<0.05）。结论 HgCl2对斑马鱼发育有明显影响，主要表现为脊柱弯曲和卵黄囊肿，其行为变化可能与nrxn2a的表达变化有关。

氯化汞；斑马鱼；轴突蛋白；细胞凋亡；行为，动物

金属汞（Hg）广泛应用于化学、医药、冶金以及电器仪器等行业［1］，对环境造成持续的污染，是严重威胁人类健康的重金属之一［2-3］。Hg可通过血胎屏障进入胎儿中枢神经系统［4］。另外，运动神经元可选择性地吸收和储存低剂量无机Hg，这种吸收可能导致神经元的传导速度变慢［5］。流行病学研究也表明，早期的Hg暴露可能导致儿童神经发育性疾病，进而发展为神经精神性疾患，例如自闭症、焦虑和抑郁等［6］。

轴突蛋白（neurexins，Nrxn）属于突触黏附蛋白家族，参与细胞识别和细胞黏附，在突触生成中具有重要作用。在哺乳动物中，Nrxn是由3个不同的基因编码（nrxn1，2和3），每个基因有2个亚型，分别由2个不同的启动子控制，较长的α形式和较短的β形式，每个亚型可被剪接为成千上万的变异亚型［7］。这6种主要的Nrxn功能有部分重叠，以不同的形式分布在各类神经元中。Nrxn通过与神经连接蛋白相连调控谷氨酸能或γ-氨基丁酸能神经突触的分化［8］。最近研究表明，多种认知疾病与编码nrxn和神经配蛋白的基因突变有关，例如自闭症、精神分裂症和智力障碍［9-10］。在动物实验中，大鼠兴奋性突触的nrxn2a突变会导致与神经疾病有重要关系的N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）功能的改变［11］。虽然早期Hg暴露可损伤神经系统功能，但对nrxn2a基因表达的影响尚未见报道。

近年来，斑马鱼因其与人类基因组的同源性高达87%，生命周期短，产卵量高且胚胎透明，体外发育易于观察，不断被用于行为学、免疫学和毒理学研究，使其成为研究人类疾病的模式生物和新药筛选的重要工具［12］。斑马鱼的基因组测序已基本完成，并被证实是一个良好的环境毒物的研究模型［13］，包括研究重金属和污染物的累积效应。本研究旨在研究氯化汞（HgCl2）对斑马鱼的早期发育毒性、nrxn2a基因表达及神经行为的影响，为探讨HgCl2致斑马鱼神经行为改变的机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

HgCl2、亚甲基蓝、三甲卡因和吖啶橙（acridine orange，AO）均购自美国Sigma公司；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR（q-PCR）试剂盒均购自日本TaKaRa公司；酶联地高辛抗体和T7 RNA多聚酶购自瑞士Roche公司。体式荧光显微镜来自日本Olympus公司；实时荧光定量PCR仪（Stratagene MX3000P）购自美国Agilent公司；Viewpoint Lab观测系统购自法国Viewpoint Life Sciences公司。

1.2 动物饲养和鱼卵采集

AB型斑马鱼由南方医科大学斑马鱼模式动物重点实验室和人类疾病药物筛选研究所提供。斑马鱼的养殖和繁殖参照Westerfield的方法［14］。光照周期14 h∶10 h，水温27 ～29℃，养鱼系统循环水为去离子水加海盐，电导率保持为（880±20）μs·cm-1，用NaHCO3调节pH值约为7.0。使用新鲜孵化的丰年虾喂养，每日2次。

实验前1 d晚间将成鱼放入交配缸，雌雄比例为1∶1。次日清晨取隔板后，采集30 min内所产受精卵，用循环水清洗2遍后放入孵化液中，同时加入亚甲基蓝溶液防止真菌产生，于28.5℃继续孵化。受精后2 h（2 h post fertilization，2 hpf）体式显微镜下观察，确定发育阶段［15］并选择正常受精卵备用。

1.3 斑马鱼胚胎和幼鱼染毒

参考OECD标准［16］，每个培养皿放置50个受精卵，加入30 mL培养液，6 hpf内进行染毒。参照文献［17］及预实验确定胚胎暴露浓度为0，0.2，0.4和0.8 μmol·L-1，每个浓度设置3个复样。将培养皿置于孵箱中，在光照昼夜比为14 h∶10 h的光周期下进行培养。为检测不同浓度重金属对斑马鱼死亡率、孵化率和畸形率的影响，分别在24，48，72，96和120 hpf用体式显微镜观察并记录每种重金属实验组和正常对照组胚胎和幼鱼存活、孵化和发生畸形的数量。以心脏跳动停止和卵凝结为死亡的终点。畸形包括脊柱弯曲和心包囊肿等畸形状态，并对各观察终点计算50个胚胎中死亡、孵化和畸形比率。

1.4 用电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasmamassspectrometry，ICP-MS）测定Hg含量

在3 d（3 d post fertilization，3 dpf）后收集各组斑马鱼，洗涤3遍后吸干液体放于-80℃进行冷冻干燥。用微波消化炉进行消化，定溶于25 mL容量瓶后进行Hg含量测量。

1.5 用轨迹录像记录检测神经行为

将各处理组斑马鱼饲养至受精后5 dpf，选取形态学正常的幼鱼进行行为学观察。将幼鱼置于96孔板中，每孔1条，200 μL培养液，每个处理组24条。先将96孔板放入Viewpoint Lab观测系统内适应15 min［18］，采集5 min幼鱼自发运动视频，由于斑马鱼的自发运动在不同时间的差异较大，故每条幼鱼采集3次，记录5 min内幼鱼移动距离和活动次数，计算每分钟移动距离和活动比例等运动参数。活动比例（%）=每分钟活动次数/（每分钟活动次数+每分钟不活动次数）×100%。每分钟活动次数和不活动次数由自定义软件Open Office.Org2.4进行界定，并用该软件进行部分数据的初步分析。

1.6 吖啶橙染色检测细胞凋亡

在各个处理组处理3 dpf后，随机选取每个处理组20条幼鱼转移到AO 2 mg·L-1的溶液（用PBS稀释）中避光处理15 ～20 min。用新的PBS冲洗胚胎2次。随后在0.16 g·L-1三甲卡因（用PBS稀释）中处理5 ～10 min麻醉幼鱼。在荧光体视显微镜下拍照，绿色荧光标记的细胞为AO染色的阳性凋亡细胞，测定整条鱼的凋亡细胞，实验重复3次。

1.7 原位杂交法检测nrxn2aa和nrxn2abmRNA定位

利用T7RNA聚合酶体外转录系统从线性化模板DNA合成地高辛标记的探针。12 hpf斑马鱼加入0.0045%1-苯基-2-硫脲（1-phenyl-2-thiourea，PTU）抑制色素生成，增加透明性。收集各浓度Hg⁃Cl2处理24，48和72 hpf的斑马鱼正常胚胎各6个，实验步骤参照Thisse的方法［19］。将收集样本重新水化和固定；60℃水浴预杂交>4 h；加入探针60℃温浴过夜；探针回收，加入酶联地高辛抗体4℃冰箱过夜；显色和拍照。

1.8 q-PCR检测nrxn2aa和nrxn2abmRNA表达

收集各浓度HgCl2处理24，48和72 hpf的斑马鱼正常胚胎各30个，按照Trizol说明书进行操作，提取总RNA。用逆转录酶合成cDNA。以cDNA为模板进行q-PCR反应。以GAPDH作为参照。反应条件为：95℃15 s；55℃20 s；72℃20 s；共40个循环。nrxn2aa引物，上游：GCCTCCATGCACCTCTTCTT，下游：TGTCATTGAGCGGCTT⁃GTCG；nrxn2ab引物，上游：CAACGGATGGGA⁃CAAATGGG，下游：GTGGTGCTCAGGCTG⁃GAAGA；GAPDH引物，上游：TCTGACAGTCC⁃GTCTTGAGAAA，下游：ACAAAGTGATCGTT⁃GAGAGCAA。用溶解曲线检测特异性，用标准曲线确定扩增效率。每个时间点和浓度均重复3次。

1.9 统计学分析

实验结果计量资料数据以x±s表示，利用SPSS软件进行one-way ANOVA分析，两两比较采用Bonferroni法，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HgCl2暴露对斑马鱼死亡率、孵化率和畸形率的影响

图1可见，斑马鱼死亡率随着HgCl2浓度的增加而上升，0.8 μmol·L-1处理组斑马鱼在120 hpf时的死亡率达到90%。HgCl20.4 μmol·L-1处理组在48 hpf时的孵化率高于正常对照组（P<0.01），72 hpf时正常对照组和处理组胚胎全部孵化，没有明显差异（因为正常生理情况下，72 hpf时斑马鱼已经完成孵化）。另外，随着HgCl2浓度的增加，斑马鱼的畸形率不断升高，HgCl20.2 μmol·L-1处理组约为3.5%，0.4 μmol·L-1处理组约为30%，而0.8 μmol·L-1处理组在96和120 hpf时畸形率>98%。

2.2 HgCl2暴露在斑马鱼体内的蓄积

图2结果显示，随着HgCl2暴露浓度的增加，斑马鱼体内Hg含量明显增加，说明斑马鱼体内出现明显的Hg蓄积。

2.3 HgCl2暴露对斑马鱼自发活动的影响

Fig.2 Absorbed contents of Hg2+in zebrafish larvae after exposure to HgCl2for 3 d. x±s，n=3.**P<0.01，compared with normal control group.

对HgCl2处理5 d后的斑马鱼进行行为监测，观察5 min内的自发活动。由于HgCl20.8 μmol·L-1处理组斑马鱼死亡率过高，故选取HgCl20.2和0.4 μmol·L-1处理组进行检测。结果发现，与正常对照组相比，两组每分钟运动距离和活动程度减少（P<0.01）（表1），表明HgCl2可抑制斑马鱼的自发活动。

Tab.1 Locomotor behavior of zebrafish after exposure to HgCl2for 5 d

2.4 HgCl2暴露对斑马鱼胚胎细胞凋亡的影响

选取HgCl20.2和0.4 μmol·L-1处理组进行检测。如图3所示，高亮的绿色斑点即为凋亡细胞，处理组斑马鱼的凋亡细胞主要集中在脑和脊柱部分，HgCl20.4 μmol·L-1组的凋亡细胞数目显著高于正常对照组（P<0.01）。

Fig.1 Mortality（A），hatchability（B）and malformation（C）in larval zebrafish after exposure to HgCl2for 120 h post fertilization（hpf）.x±s，n=3.*P<0.05，**P<0.01，compared with normal control（0）group.

Fig.3 Apoptosis analysis in zebrafish larvae stained with acridine orange（AO）.Zebrafish was exposed to HgCl2for 3 d post fertilization（dpf）.B was the quantitative results of A.x±s，n=3.**P<0.01，compared with normal control group.The arrows show apoptosis.

Fig.4 Expression ofneurexin（nrxn）2aaandnrxn2abin zebrafish exposed to HgCl20.4 μmol·L-1.From whole mountin situhybridization，nrxn2aa（A）andnrxn2ab(B)（left：lateral view；right：dorsal view）were mainly expressed in the central nervous system and the mRNA level of the two genes was detected by qPCR in 24（C），48（D）and 72 hpf（E）.x±s，n=3.*P<0.05，**P<0.01，compared with normal control group.

2.5 HgCl2暴露对斑马鱼nrxn2a表达的影响

由图4A和4B的原位杂交图片可以看出，nrxn2aa和nrxn2ab的表达主要集中于脑和脊柱，尤其在48 h时在脑部居多。由图4C，4D和4E的 RT-PCR与正常对照组相比，HgCl2处理组在24和72 hpf两个时间点时，nrxn2aamRNA表达上调，分别为正常对照组的1.64（P<0.01）和1.46（P<0.05）倍；nrxn2abmRNA表达在24和48 hpf时低于正常对照组（P<0.05）。而nrxn2aa在48 hpf时间点以及nrxn2ab在72 hpf时间点，处理组与正常对照组相比差异无统计学意义。

3 讨论

斑马鱼除具有易饲养、实验操作方便等特点外，胚胎和早期幼鱼在神经发育毒性研究中又有独特优势［20-21］。Korbas等［22］研究表明，斑马鱼能够吸收环境中的Hg至脑、眼、脊柱等各器官和细胞内，从而对斑马鱼的视觉和运动产生危害。本研究发现，随着HgCl2暴露浓度的升高，斑马鱼体内Hg含量增加。斑马鱼运动行为按照固定的顺序发育，发育到5 dpf开始能够产生运动、探索、学习等一系列复杂行为的变化。行为学的检测虽然相对比较简单，但可以从宏观上早期发现外源性化合物引起的神经功能性障碍，较引起器质性改变后的病理学检查更为直接、敏感并且经济、有效。本研究结果表明，通过低剂量HgCl2的暴露，斑马鱼活动受到一定程度的抑制，活动时间和游动距离均有降低。有研究认为，Hg暴露能够损伤斑马鱼的中枢神经系统从而影响斑马鱼的运动［23］。但斑马鱼运动抑制产生的原因是否与Hg中毒所致的中枢神经和运动神经功能障碍相关或是由于如眼、骨骼肌发育不良等相关组织有关尚需进一步研究。

Ung等［24］研究表明，Hg的肝毒性是由氧化应激、凋亡通路触发。Hg能够下调核受体和Gsk3激酶活性，导致线粒体功能障碍。Gonzalez等［25］研究发现，HgCl2也能引起斑马鱼肝、骨骼肌和脑细胞的凋亡。本研究AO染色结果显示，HgCl2可以导致斑马鱼体内细胞凋亡明显增多，凋亡细胞遍布全身，主要集中在脑和脊柱部分。但HgCl2导致细胞凋亡的具体机制有待进一步研究。

Nrxn是一类重要的神经黏附分子，它和神经连接蛋白是分别位于突触前膜和突触后膜的跨膜蛋白。这两种蛋白可以相互结合，在突触的组装、分化以及突触发挥其传递信息的功能方面起到核心的调控作用。越来越多的研究显示，nrxn基因突变与多种认知障碍有关，例如自闭症、精神分裂症和智力缺陷［7］。Pizzarelli等［26］等研究表明，nrxn2a的突变会增加患自闭症的风险。Dachtler等［27］nrxn2a基因敲除小鼠实验提示，nrxn2a基因缺失和小鼠自闭症样行为发生有因果关系。流行病学调查发现，自闭症儿童患者体内Hg的含量明显高于正常对照组［28］。本研究通过原位杂交技术对nrxn2a时空表达进行检测，发现nrxn2a主要表达在大脑和脊柱区域，这与See等［29］研究结果相一致，即nrxn2a在脑和脊柱均有表达，2个亚型nrxn2aa和nrxn2ab均在24 hpf达到高峰，在31 hpf表达开始降低。在24 hpf，nrxn2aa表达主要集中在脑，而nrxn2ab表达在脑和脊柱比较均匀。这些表达方式提示，二者可能在脑的发育过程中均起到重要作用。

本研究通过Viewpoint Lab系统对斑马鱼进行行为学监测，发现经过HgCl2暴露的斑马鱼，活动时间和每分钟移动距离都降低。同时qPCR检测发现斑马鱼脑和脊柱区域nrxn2a的mRNA水平表达改变，提示HgCl2可能通过影响神经系统nrxn2a的表达而导致斑马鱼神经行为学的改变，为HgCl2神经毒性作用机制的探讨提供了一个新的视角。

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Effect of HgCl2on zebrafish embryonic development and nuerexin2a gene expression

FAN Cheng-ji1*，TU Hong-wei1*，CHEN Xiao-hui2，LIU Jia-xian1，PENG Tao1，MENG Xiao-jing1
（1.Department of Occupational Health and Occupational Medicine，Guangdong Provincial Key Laboratory of Tropical Disease Research，School of Public Health and Tropical Medicine，2.Key Laboratory of Zebrafish Modeling and Drug Screening for Human Diseases of Guangdong Higher Education Institutes，Department of Developmental Biology，School of Basic Medical Sciences，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China）

OBJECTIVE To investigate the developmental toxicology of mercury chloride（HgCl2）in zebrafish embryos and larvae，and determine its effects on neurobehavior and neurexin（nrxn）2agene expression.METHODS Wild-type zebrafish embryos/larvae were exposed to HgCl20.2-0.8 μmol·L-1.The mortality，hatching rate and malformation of zebrafish were determined.The content of Hg in zebrafish was detected by inductively coupled plasma mass spectrometry（ICP-MS）analysis.Locomotor activity of zebrafish larvae was detected by a Video-Track system.Cell apoptosis in embryos was observed by the staining of acridine orange（AO）.Expression ofnrxn2awas examined byin situhybridization and quantitative PCR（qPCR）.RESULTS Compared with control，mortality started to increase after the zebrafish was treated with HgCl20.8 μmol·L-1for 72 h and reached 94%at 120 h post fertilization（hpf）（P<0.01）.Moreover，the hatching rate was significantly increased in the zebrafish treated with HgCl20.4 μmol·L-1for 48 h.HgCl2had significantly deleterious effects on zebrafish embryonic development，as mainly evidenced by spinal curvature and yolk edema.Malformation and Hg accumu⁃lation were markedly increased（P<0.05，P<0.01）.The content of Hg reached 77 μg·g-1in zebrafish treated with HgCl20.8 μmol·L-1.Moreover，compared with control，the velocity and the proportion of activity were significantly inhibited，while the apoptosis was markedly increased in zebrafish larvae exposed with HgCl20.4 μmol·L-1（P<0.05，P<0.01）.mRNA level ofnrxn2aawas up-regulated in zebrafish embryos at 24 hpf（P<0.01）and 72 hpf（P<0.05），while mRNA level ofnrxn2abwas down-regulated at 24 and 48 hpf（P<0.05）.CONCLUSION The development of zebrafish embryos and larvae is inhibited because of toxicity of HgCl2，which is probably associated with changes innrxn2aexpression.

HgCl2；zebrafish；neurexin2a；apoptosis；behavior，animal

MENG Xiao-jing，E-mail：xiaojingmeng@smu.edu.cn，Tel：（020）61648471

R396.4

A

1000-3002-（2016）08-0860-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.08.010

Foundation item：TheprojectsupportedbyNationalBasicResearchProgram ofChina（2012CB525004）

2016-03-04接受日期：2016-07-17）

（本文编辑：齐春会）

国家重点基础研究发展计划（2012CB525004）

樊成吉，硕士研究生，主要从事重金属毒物的神经毒性作用及机制研究。

孟晓静，E-mail：xiaojingmeng@smu.edu.cn，Tel：（020）61648471

*共同第一作者。

*Co-first author.