新型酪氨酸激酶抑制剂B-1对U251胶质瘤细胞存活和凋亡的影响

杨媛媛，王康敏，张士坤，宋锦文，檀英霞，李素波，高红伟，季守平，宫 锋

（1.军事医学科学院野战输血研究所，北京 100850；2.成都知普莱生物医药科技有限公司，四川成都 610000）

·论 著·

新型酪氨酸激酶抑制剂B-1对U251胶质瘤细胞存活和凋亡的影响

杨媛媛1，王康敏2，张士坤1，宋锦文1，檀英霞1，李素波1，高红伟1，季守平1，宫 锋1

（1.军事医学科学院野战输血研究所，北京 100850；2.成都知普莱生物医药科技有限公司，四川成都 610000）

目的 探讨GNF-5837修饰改造而合成的神经生长因子受体酪氨酸激酶A（TrkA）抑制剂B-1对胶质瘤U251细胞存活和凋亡的影响，为恶性胶质瘤治疗提供新的思路。方法 B-1和GNF-5837 1.0×10-11～ 1.0×103mol·L-1分别与TrkA激酶作用1 h，ADP-Glo™激酶检测法测定TrkA活性；MTT法检测胶质瘤U251细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）存活率；直接计数法检测胶质瘤U251细胞集落形成；流式细胞仪检测胶质瘤U251细胞凋亡率；Western蛋白印迹法检测BAD、BCL-2和胱天蛋白酶原3蛋白表达水平。结果B-1和GNF-5837对TrkA活性的抑制作用相近，IC50值分别为4.7±1.0和（4.3±1.7）nmol·L-1；B-1可浓度依赖性抑制胶质瘤U251细胞的存活（r=0.968，P<0.01），14 μmol·L-1时存活率降到50%；且B-1对HUVEC的IC50约为31 μmol·L-1，高于GNF-5837的IC5013 μmol·L-1；B-1浓度依赖性抑制U251细胞集落形成能力（r= 0.959，P<0.05）；与细胞对照组相比，B-1 10 ～40 μmol·L-1作用72 h后U251细胞的凋亡率升高（P<0.01）；U251细胞内促凋亡蛋白BAD水平显著上升（P<0.01），而抗凋亡蛋白BCL-2和胱天蛋白酶原3表达水平降低（P<0.01）。结论 B-1能抑制胶质瘤U251细胞存活，其机制与B-1通过抑制Trk活性及下游信号通路，降低抗凋亡蛋白水平的同时增加促凋亡蛋白水平，最终诱导其凋亡有关。

酪氨酸激酶抑制剂；B-1；细胞，U251；细胞增殖；细胞凋亡

目前神经胶质细胞瘤的治疗手段仍是手术切除加放化疗，患者的预后较差，中位生存期不足12个月［1］。如何提高胶质瘤的疗效是目前肿瘤治疗的一个难点。酪氨酸激酶（tyrosine kinases，Trk）家族属于神经营养因子受体家族，包括TrkA，TrkB和TrkC等［2］。Trk为跨膜蛋白，由3部分组成，即含有配体结合位点的细胞外结构域、单次跨膜的疏水α螺旋区及含有受体Trk活性的细胞内结构域［3］。神经营养因子通过黏附和激活跨膜Trk受体激酶而发挥调节细胞的作用。近年研究表明，神经生长因子与其受体结合后的信号通路不仅可以调节神经细胞的生物学功能，而且在多种肿瘤的增殖、抗凋亡和转移等中发挥重要作用，与肿瘤的发生发展密切相关［4-6］。Lawn等［7］报道，胶质瘤细胞中部分Trk亚型的高表达与肿瘤的生长和侵袭相关，有可能成为胶质瘤治疗的新靶标。最近，Iyer等［8］报道，Trk抑制剂可有效抑制胶质瘤的生长。

GNF-5837是一种小分子Trk抑制剂，分子式为C28H21N5O2F4，相对分子质量为535.49。GNF-5837通过竞争性结合受体Trk，抑制其下游蛋白的磷酸化，从而阻断丝/苏氨酸激酶等信号通路，发挥抗肿瘤作用。然而，GNF-5837对正常细胞也有一定的杀伤作用，会产生较强的毒副作用。因此，我们对GNF-5837进行修饰改造，合成一系列新型Trk抑制剂，经过筛选得到了抗肿瘤活性较高且毒副作用小的候选化合物B-1。本研究主要针对B-1对胶质瘤生物学行为的影响进行研究，期望能获得高效低毒的胶质瘤治疗药物，从而为临床治疗神经胶质瘤提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物、试剂和仪器

胶质瘤细胞U251和正常人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）均为美国ATCC公司，由本室保存。GNF-5837（图1A）和合成的抑制剂B-1（图1B）均由成都知普莱生物医药科技有限公司提供，B-1的化学名称为：（Z）-1-（3-（（3-（（N-（2-（二乙基氨基）乙基）2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺-5-）亚甲基）-2-吲哚啉-6-基）胺基）-4-甲基苯基）-3-（4-硝基）苯基）。胎牛血清购自杭州四季青生物技术有限公司；DMEM培养基，美国Gibico公司；MTT，DMSO和β肌动蛋白抗体，美国Sigma公司；TrkA激酶系统和ADP-GloTM激酶检测试剂盒，美国Promega公司；ATP，美国Invitrogen公司产品；胱天蛋白酶原3、BCL-2和BAD抗体（一抗），中国Proteintech公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠和羊抗兔二抗，碧云天生物技术研究所；早期凋亡蛋白检测试剂盒（AnnexinⅤ-FITC），天津三箭生物公司；化学发光试剂盒，德国Thermo公司产品。酶标仪，美国Molecular Devices公司；FACS Calibur流式细胞仪和Western电泳仪，均为美国BD公司；细胞培养箱，日本三洋电器公司产品；细胞培养板，美国Corning公司。

Fig.1 Chemical structure of GNF-5837（A）and new nerve growth factor receptors tropomyosin kinase（Trks）inhibitor B-1（B）.

1.2 细胞培养和药物配制

U251细胞和HUVEC细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基置于37℃，5%CO2培养箱中培养，采用胰酶消化法进行传代。称取适量药物以DMSO溶解为100 μmol·L-1，4℃保存备用。每次实验前用新鲜培养液按一定比例稀释到终浓度（0，3.5，7.0，10.5，14.0，17.5和35.0 μmol·L-1），所有实验中DMSO的终浓度均<0.05%，对实验结果无显著影响。

1.3 ADP-GloTM激酶法测定TrkA活性

将B-1和GNF-5837用DMSO稀释成1 mmol·L-1待用，3倍比稀释成12个浓度梯度，分别取2 μL加入到38 μL 1×激酶缓冲液中；同时制备500 μg·L-1的TrkA缓冲液，250 μg·L-1Poly E4Y1（反应底物）和50 μmol·L-1ATP激酶缓冲液。在384孔板中依次加入2 μL TrkA、1 μL不同浓度的抑制剂溶液，室温放置30 min后，加入2 μL底物溶液，反应60 min。随后加入ADP-GloTM5 μL，室温静置40 min；加入10 μL检测缓冲液，室温40 min。Perkin Elmer Envision 2104读取相对光单位（relative light unit，RLU）信号值。RLU信号值即表示抑制率，采用Graphpad Prism5.0计算IC50。

1.4 MTT法测定细胞存活率

取对数生长期U251和HUVEC细胞，经胰酶消化后吹打成单细胞悬液，调整密度为2×108L-1，接种于96孔板中，每孔100 μL。培养24 h后，弃去原液，加入含有不同浓度B-1和GNF-5837的新培养基，每个浓度设置6个平行复孔，另设细胞对照组和空白对照组。置于37℃，5%CO2培养箱中培养72 h，各孔加入MTT（5 g·L-1）20 μL，继续培养4 h后，弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，充分振荡混匀后，用酶标仪检测490 nm处的吸光度值A490nm。细胞存活率（%）=（药物处理组A490nm-空白对照组A490nm）/（正常对照组A490nm-空白对照组A490nm）× 100%。

1.5 细胞集落形成测定

取对数生长期的U251细胞，分别用胰酶消化并吹打成单个细胞，计数板计数。将细胞悬液稀释成每毫升100个，以每孔200个接种于6孔板中，轻轻晃动混匀，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。第2天加入B-1使终浓度为0，3，4和5 μmol·L-1，每浓度设3复孔。培养2周后终止培养，弃去上清液，用PBS洗2次，加入4%多聚甲醛固定15 min，然后弃去固定液并加入适量结晶紫染料染色30 min。弃去染料，用PBS洗3 ～5次，空气干燥。用肉眼直接计数，并在显微镜下计数>50个细胞的克隆数。

1.6 流式细胞仪检测细胞早期凋亡

用不同浓度B-1处理U251细胞72 h后，经胰酶消化后制成单细胞悬液，离心去上清，再用预冷的PBS洗2次，400×g离心5 min，弃上清，按照早期凋亡蛋白AnnexinⅤ-FITC检测试剂盒说明书依次加入结合缓冲液和AnnexinⅤ-FITC，避光10 min后上机测试。采用FACS Calibur流式细胞仪对样品进行检测，CellQuest Pro软件进行分析。

1.7 Western蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白的表达

收集不同浓度B-1处理72 h后的U251细胞，用预冷的PBS洗涤细胞，1000×g离心5 min后弃上清，重复2次。用加PMSF抑制剂的细胞裂解液RI⁃PA冰上裂解细胞30 min，12 000×g离心10 min，取裂解上清液用BCA蛋白检测试剂盒，在562 nm波长下测定样品吸光度，进行总蛋白质定量。将蛋白样品与5×蛋白上样缓冲液以4∶1比例混匀后，沸水浴10 min使蛋白变性。常规制胶、上样、电泳、转膜、封闭。分别加抗β肌动蛋白（1∶10 000）、BAD（1∶500）、胱天蛋白酶原3（1∶500）和BCL-2（1∶500）抗体（一抗），4℃孵育过夜。洗膜后，分别加入HRP标记的二抗（1∶4000），室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，最后化学发光液暗室曝光显影。采用Image-Pro Plus软件分析蛋白条带的积分吸光度值，以目的蛋白与内参β肌动蛋白积分吸光度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。

1.8 统计学分析

实验结果数据用x±s表示，利用SPSS 20.0统计分析软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 B-1对TrkA活性的抑制作用

化合物B-1和GNF-5837对TrkA活性的抑制作用见图2。B-1与GNF-5837相比，抑制率的拟合曲线几乎重合，作用1 h后IC50值分别为4.7±1.0和（4.3±1.7）nmol·L-1，二者对TrkA活性的抑制作用相近。

Fig.2 Effect of B-1 and GNF-5837 for 1 h on tyrosine kinase A（TrkA）enzyme activity detected by ADP-GloTMkinase assay.n=2.

2.2 B-1对U251细胞和HUVEC存活的影响

由图3A可以看出，与GNF-5837相比，同浓度的B-1能够显著抑制U251细胞的存活（P<0.01），且呈浓度依赖性（r=0.968，P<0.01）。当B-1为14 μmol·L-1时，细胞存活率降低至50%。由图3B可以看出，B-1和GNF-5837对HUVEC的毒性作用随浓度增高而增加，且B-1处理后HUVEC细胞活性明显高于GNF-5837处理组（P<0.01），说明B-1对HUVEC的细胞毒性作用小于GNF-5837。

Fig.3 Effect of B-1 and GNF-5837 on survival of U251 cells（A）and human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）（B）determined by MTT assay.U251 cells and HUVEC were treated with B-1 and GNF-5837 for 72 h，respec⁃tively.x±s，n=6.**P<0.01，compared with corresponding GNF-5837 group.

2.3 B-1对U251细胞集落形成的影响

由图4可以看出，B-1 3，4和5 μmol·L-1组克隆形成个数分别为31.0±2.0，15.0±2.0和8.7±1.5，与对照组43.0±3.6相比明显减少（P<0.01），表明B-1明显抑制U251细胞的克隆形成能力，且呈浓度依赖性（r=0.959，P<0.05）。

2.4 B-1对U251细胞早期凋亡的影响

Fig.4 Effect of B-1 on ability of colony formation of U251 cells.U251 cells were treated with B-1 for 2 weeks.B was the quantitative result of A.x±s，n=3.**P<0.01，compared with cell control（0 μmol·L-1）group.

Fig.5 Effect of B-1 on U251 cell eraly apoptosis detected by flow cytometry.U251 cells were exposed to B-1 for 72 h.A，B，C，D and E：B-1 0，10，20，30 and 40 μmol·L-1，respectively；F：quantitative result.x±s，n=3.**P<0.01，compared with cell control（0 μmol·L-1）group.

如图5结果所示，B-1 10 ～40 μmol·L-1处理胶质瘤U251细胞72 h后用流式细胞仪检测细胞早期凋亡。与细胞对照组相比，B-1各组的凋亡率明显增加（P<0.01），呈浓度依赖性（r=0.994，P<0.01）。

2.5 B-1对凋亡相关蛋白表达水平的影响

B-1 10 ～30 μmol·L-1处理胶质瘤U251细胞72 h，用Western蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白胱天蛋白酶原3、BCL-2和BAD蛋白表达水平。结果表明，与正常对照组相比，促凋亡蛋白BAD表达水平显著升高（P<0.01）；而抗凋亡蛋白BCL-2和胱天蛋白酶原3表达水平均降低（P<0.01）（图6）。

Fig.6 Effect of B-1 on protein expression levels of pro-caspase3（A），BCL-2（A）and BAD（B）in U251 cells detected by Western blotting.U251 cells were exposed to B-1 for 72 h.C：semi-quantitative result of A and B.x±s，n=3.**P<0.01，compared with corresponding cell control（0 μmol·L-1）group.

3 讨论

目前认为，神经胶质瘤的产生源于遗传的积累和控制生物学行为如调节细胞凋亡、细胞周期及增殖等的关键基因的改变［9］。细胞凋亡的异常与肿瘤的发生密切相关，因此在抗肿瘤药物的研发中，大多是通过诱导肿瘤细胞凋亡来预测抗肿瘤作用的［10］。研究表明，Trk在包括胶质瘤等多种肿瘤细胞中高表达预示患者存活率低、预后差［11-12］。Trk可以调控包括磷脂酰肌醇-3-激酶-丝/苏氨酸激酶信号通路在内的多种信号通路的活化，从而在肿瘤细胞的增殖、凋亡过程中发挥重要作用。

研究表明，含有Michael-受体的化学小分子具有较高的生物学活性，尤其是对含半胱氨酸残基的蛋白酶有抑制活性［13］。因此，来那替尼、达克替尼和阿法替尼等Trk抑制剂抗肿瘤药物的分子结构中都含有亲电的基团Michael-受体［14］。有鉴于此，我们与成都知普莱生物医药科技有限公司合作，以原肌球蛋白受体激酶抑制剂GNF-5837为研究对象，在其母核上引入了Michael-受体及氨基等结构，合成了一系列化合物。通过初步筛选，获得了激酶抑制活性较好且毒副作用小的抑制剂B-1。研究结果表明，新合成的抑制剂B-1和GNF-5837均可显著抑制TrkA激酶的活性，两者的抑制能力无显著差异。在药物的敏感性研究中，B-1对胶质瘤U251细胞增殖的抑制率随着药物浓度的增加而升高，其杀伤肿瘤细胞的效率略高于GNF-5837，提示新合成的Trks抑制剂B-1可能对胶质瘤细胞具有更强的杀伤能力。B-1处理胶质瘤U251细胞后其克隆形成能力也显著降低。本研究还比较了2个抑制剂对HUVEC的毒性，发现新合成的化合物B-1对HUVEC的细胞毒性低于GNF-5837。以上结果提示，B-1对胶质瘤细胞的杀伤效果更好、细胞毒性更低。

为研究B-1的作用机制，以FITC标记的早期凋亡蛋白（AnnexinⅤ-FITC）为指标，用流式细胞仪检测B-1处理后胶质瘤U251细胞的早期凋亡率，表明B-1具有较强的诱导胶质瘤U251细胞凋亡的能力。进一步检测B-1处理后胶质瘤U251细胞内凋亡相关蛋白的表达水平，发现促凋亡蛋白BAD表达水平显著升高，抗凋亡蛋白BCL-2和胱天蛋白酶原3表达水平均降低，提示B-1有可能通过抑制Trk活性及其下游信号通路，降低抗凋亡蛋白水平的同时增加促凋亡蛋白水平，最终诱导胶质瘤细胞凋亡，达到杀伤胶质瘤细胞的目的。

综上所述，B-1是一个相对高效低毒的Trk抑制剂，可通过诱导细胞凋亡达到杀伤肿瘤细胞的效果，有可能成为一个有应用前景的胶质瘤靶向药物。下一步将对其诱导细胞凋亡、杀伤胶质瘤的机制进行深入研究，为其临床治疗应用打好基础。

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Effect of new tyrosine kinase inhibitor B-1 on survival and apoptosis of human U251 glioma cells

YANG Yuan-yuan1，WANG Kang-min2，ZHANG Shi-kun1，SONG Jin-wen1，TAN Ying-xia1，LI Su-bo1，GAO Hong-wei1，JI Shou-ping1，GONG Feng1
（1.Institute of Transfusion Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China；2.Chengdu Zeple Tech inc.，Chengdu 610000，China）

OBJECTIVE To detect the effect of a new nerve growth factor receptor tropomyosin ki⁃nase（Trks）inhibitor B-1，a derivative of GNF-5837，on survival and apoptosis of human glioma U251 cells so as to provide a potential molecular target therapy for human glioma.METHODS After being treated with different concentrations of B-1 and GNF-5837（1.0×10-11-1.0×103mol·L-1）for one hour re⁃spectively，TrkA activity was detected by ADP-Glo™kinase assay.The survival of B-1 and GNF-5837 treat⁃ed U251 and human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）were detected by MTT method.The clone formation unit of treated U251 cells was directly counted.The apoptotic rate of treated U251 cells was determined by FACS with AnnexinⅤ-FITC/PI method.The expression levels of apoptosis-regulated proteins（BAD，BCL-2 and pro-caspase 3）in treated U251 cells were detected by Western blotting. RESULTS B-1 and GNF-5837 had similar inhibitory effects against TrkA，and the IC50values were 4.7±1.0 and（4.3±1.7）nmol·L-1respectively.The survival fraction of U251 cells was inhibited by B-1 in a con⁃centration-dependent manner（r=0.968，P<0.01）.The inhibition rate reached 50%at 14 μmol·L-1.However，the IC50value ofB-1 in HUVEC cells was 31 μmol·L-1，better than that ofGNF-5837（IC50= 13 μmol·L-1）。The colony formation ability of B-1 treated U251 cells decreased in a concentration-depen⁃dent manner（r=0.959，P<0.05）.After being treated with B-1 10-40 μmol·L-1for 72 h，the apoptosis rate of U251 cells increased，compared with cell control group.The level of pro-apoptosis protein（BAD）（P<0.01），and anti-apoptosis proteins（BCL-2 and pro-caspase3）in U251 cells decreased（P< 0.01）.CONCLUSION The new TrkA inhibitor B-1 can inhibit U251 glioma cell growth.The mechnism may be related to the ability of B-1 to inhibit the activity of Trk，decrease the anti-apoptosis protein expres⁃sion，increase the pro-apoptosis protein expression and induce cell apoptosis.

tyrosine kinase inhibitors；B-1；cells，U251；cell proliferation；apoptosis

JI Shou-ping，E-mail：1492466132@qq.com，Tel：（010）66931937

R979.1

A

1000-3002-（2016）08-0833-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.08.006

2016-03-10接受日期：2016-08-02）

（本文编辑：齐春会）

杨媛媛，女，硕士研究生，主要从事胶质瘤耐药性研究，E-mail：yangyuanyuanchina@163.com，Tel：（010）66931545

季守平，E-mail：1492466132@qq.com，Tel：（010）66931937