淡水沙梨外植体培养技术研究

宋冠华，沙 洁，王绍芬，叶翰江，曾令达*

（1.惠州学院生命科学学院，广东惠州 516007；2.惠州市惠阳区水果办，广东惠州 516014）

淡水沙梨外植体培养技术研究

宋冠华1，沙 洁1，王绍芬1，叶翰江2，曾令达1*

（1.惠州学院生命科学学院，广东惠州 516007；2.惠州市惠阳区水果办，广东惠州 516014）

为控制外植体褐化及促进外植体的萌芽和愈伤组织的形成，以淡水沙梨新梢为材料，以MS（Murashige and Skoog）培养基为基本培养基，添加活性炭或植物生长调节剂培养顶芽、腋芽和节间茎段.结果表明，在培养基中添加2 g/L活性炭的淡水沙梨褐化率为6.9%，而未添加活性炭的淡水沙梨褐化率为11.1%，新梢当天接种褐化率为13.3%，第二天接种的褐化率为46.7%，第四天接种的褐化率为66.7%.新梢顶芽的出芽率为48.5%，愈伤组织形成率为9.0%，腋芽的出芽率为30.3%，愈伤组织形成率为51.5%，节间无芽茎段的出芽率为0，愈伤组织形成率为45.2%.培养基中添加活性炭能降低褐化率，离体时间对外植体培养的褐化有很大影响，新梢离体时间越长，接种后褐化率越高，带顶芽的外植体比带腋芽的外植体出芽率更高.

淡水沙梨；外植体；茎段；褐化

1 前言

淡水沙梨，又名淡水红梨，原产广东惠州淡水、秋长等地，是以产地命名的地方名优水果.淡水沙梨果面红褐色，耐高温湿润气候、耐贮运，曾经是秋季出口的传统名果之一[1].淡水沙梨20世纪50年代主要栽培在叶挺将军故乡的惠阳区秋长镇，栽培面积约8 000多亩，年产量约20～30万担，苗木20万株[2].由于80、90年代惠州房地产业的高速发展，以及北方优质梨的低价冲击等原因，大部分果农因此砍伐梨树而致淡水沙梨栽培面积和数量大幅下降.淡水沙梨现存不足500株，大都进入衰老死亡期，且处于失管状态濒临绝种边缘.为快速繁殖种苗和保存地方优质水果品种资源，本实验采用淡水沙梨的新梢作为材料，研究活性炭及离体时间对淡水沙梨组织培养褐化的影响，以及不同新梢部位作为外植体培养对萌芽率和愈伤组织形成率的影响，以期为淡水沙梨的组织培养和种质资源的离体保存提供参考.

2 材料与方法

2.1 试验材料及培养基

本次试验材料为惠州市惠阳区淡水沙梨，于2016年3月下旬至4月下旬在淡水沙梨树上取当年生带芽且生长健壮无病虫的幼嫩枝条.以MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L为基本培养基，pH值为5.8～6.0.

2.2 外植体的处理

取淡水沙梨幼嫩枝条，剪去叶片，剪成4～5 cm的小段.在自来水缓流水中冲洗1 h，用洗涤剂稀释液清洗3 min，再用流水冲洗干净.用75%的乙醇溶液浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0.1%HgCl2溶液浸泡11 min，期间需要不断地摇动使茎段充分接触溶液，然后用无菌水冲洗5次，每次3 min.灭菌冲洗过后，用滤纸吸干枝条小段上的水，将材料切成0.5～1.0 cm的茎段，以备接种.

3 结果与分析

3.1 活性炭对淡水沙梨褐化的影响

在采摘淡水沙梨枝条当天进行接种培养，在未添加活性炭的MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L培养基中，接种2 h后即发现有部分外植体出现褐化，经过48 h后统计外植体的褐化率为11.1%，在添加2 g/L活性炭的培养基中，外植体的褐化率为6.9%.褐化率由对照组的11.1%下降至6.9%，下降4.2%.如表1所示.

3.2 外植体离体时间对淡水沙梨褐化的影响

将采摘的新梢用报纸包好，装在密封袋中，4℃条件下贮藏.使用不同贮藏时间的离体新梢在MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L培养基上进行接种培养.如表2，将采摘的淡水沙梨幼嫩枝条第一天进行接种培养，褐化率为13.3%，第二天接种的褐化率为46.7%，第四天接种的褐化率为66.7%.采摘后的接种材料，贮藏时间越长，接种后褐化率越高.

表1 活性炭对淡水沙梨茎段褐化的影响

表2 不同离体时间对淡水沙梨褐化的影响

3.3 不同外植体类型对芽和愈伤组织诱导的影响

如表3所示，将不同的外植体在采样当天接种到MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L培养基上进行培养，节间的无芽茎段外植体项端切口处形成愈伤组织（见图1），愈伤率达到45.2%，但是不能直接出芽，出芽率为0.利用有芽茎段进行培养，10个有芽茎段在顶端的切口处形成愈伤组织（见图2），愈伤率为32.3%.13个有芽茎段则芽萌发（见图3），其顶端形成的愈伤组织结块变薄，颜色变褐色，形成栓皮.有芽茎段出芽率为38.7%.不同类型的外植体愈伤组织均为乳白色大块近圆锥形覆盖在切口的项端，节间的无芽茎段比带节的有芽茎段的愈伤组织形成率要高.

表3 不同外植体类型对芽和愈伤组织诱导的影响

3.4 不同取材部位对芽和愈伤组织诱导的影响

将顶芽和腋芽茎段均接种在MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L培养基中培养，用顶芽进行培养，顶芽可萌发（见图4），出芽率能达到48.5%，愈伤率为9.0%，利用腋芽茎段进行培养，出芽率为30.3%，愈伤率为51.5%，利用顶芽进行培养的愈伤率会比腋芽低，顶芽的出芽率比腋芽高，说明采用顶芽进行培养比腋芽更倾向于直接出芽.如表4所示.

表4 不同取材部位对芽和愈伤组织诱导的影响

4 结论与讨论

木本植物组织培养中，褐化是影响成活的主要因素之一[3].有研究认为组织的褐化现象的产生主要是由多酚氧化酶作用于天然底物酚类物质所致[4].在本试验中，在培养基中添加活性炭能降低淡水沙梨外植体的褐化率，在2 g/L活性炭条件下，淡水沙梨培养的褐化率为6.9%，比对照组下降了4.2%.刘杰等[5]用2 g/L活性炭对鸭梨组培过程进行防褐化，褐化率由对照组的78%下降到68%，下降了10%.本次试验与刘杰等人研究结果相一致.活性炭的多孔结构能够吸附外植体产生的有害物质，从而减轻对外植体的伤害[4]，淡水沙梨的褐化率下降可能跟活性炭吸收了褐化有毒物质有关.材料贮存时间越久，越容易褐化，本实验发现淡水沙梨外植体离体时间对褐化有影响，离体时间越短，接种后褐化率越小，离采新梢时间越长，接种后褐化率越高.新梢第一天接种时，褐化率为13.3%，第四天接种时，则褐化率为66.7%.原因可能是新梢存贮时间越长，氧化物质会越多，会产生更多的有害物质对植物组织形成伤害.

淡水沙梨无芽茎段和有芽茎段有不同的离体培养表现，无芽茎段没有直接出芽，但能形成愈伤组织，愈伤率为45.2%；有芽茎段既能直接出芽，也能形成愈伤组织，出芽率和愈伤率分别为38.7%和32.3%.何志祥等[6]以翠冠梨为材料研究表明，有芽茎段更倾向于直接出芽，出芽率为93.75%，愈伤率为6.25%，无芽茎段则不能直接出芽，愈伤率为25%.田宏现等[7]以米良1号猕猴桃为试材，研究发现，有芽茎段出芽易，无芽茎段出芽难.本次试验与何志祥、田宏现等人的研究结果相一致.有芽茎段中，采用顶芽与腋芽作为外植体培养的结果有所不同，顶芽的出芽率比腋芽高，而腋芽的愈伤组织形成率比顶芽高.平秀敏等[8]用红星凤梨为试材，在组织培养中发现，顶芽比腋芽的再生率更高，徐凌飞[9]以八月红梨为试材，发现顶芽的增殖系数比腋芽高.说明在离体培养中，选用顶芽和腋芽的培养效果是不同的，顶芽比腋芽更容易直接出芽.

图1 淡水沙梨无芽茎段培养

图2 淡水沙梨腋芽茎段培养

图3 淡水沙梨腋芽茎段培养

图4 淡水沙梨顶芽茎段培养

[1]沈德绪.果树育种学（第二版）[M].北京：农业出版社，1995：135-138.

[2]陈英豪，谢炳全.淡水沙梨栽培技术调查报告[J].华南农业大学学报，1959（1）：56-65.

[3]姚洪军，罗晓芳，田砚亭.植物组织培养外植体褐变的研究进展[J].北京林业大学学报，1999（3）：78-84.

[4]崔堂兵，郭勇，张长远.植物组织培养中褐变现象的产生机理及克服方法[J].广东农业科学，2001（3）：16.

[5]刘杰，张希，POUDYAL Bharat Kumar，等.梨外植体组培褐变的影响因子及预防措施[J].果树学报，2008，25（5）：727-731.

[6]汤浩茹，刘翠琼，罗娅，等.培养基和培养条件对4个梨基因型试管苗生根的影响[J].果树学报，2006，23（2）：283-286.

[7]田宏现，曾艳玲，谭晓风，等.米良一号称猴桃的组织培养研究[J].经济林研究，2005，23（1）：7-9.

[8]平秀敏，田敏，李纪元，等.红星凤梨组织培养与快速繁殖[J].安徽农学通报，2008，14（23）：103-105.

[9]徐凌飞.梨叶片和叶柄再生体系建立的研究[D].西安：西北农林科技大学，2001：20-21.

A Study of Explant Culture Techniques of Danshui Pear

SONG Guan-hua1,SHA Jie1,WANG Shao-fen1,YE Han-jiang2,ZENG Ling-da1*
（1.College of Life Science，Huizhou University，Huizhou,Guangdong,516007; 2.Fruit Production Office,Huiyang District,Huizhou,Guangdong,516014）

In order to control browning,promote sprouting and the formation of callus of explant,selecting Danshui pear as material,and taking MS（Murashige and Skoog）as the basic medium,activated carbon and plant growth regulators have been added to cultivate terminal buds,axillary buds and internodal stems without buds.It has been revealed that the browning rate of fresh material is 7.2%after adding 2 g/L activated carbon to the medium.The browning rate is 13.3%when the picked branches have been inoculated at the same day as they were picked.And the browning rate is 46.7%and 66.7%.There is a marked difference of browning among that very day,the second day and the fourth day.The germination rate for terminal buds is 48.5%while formation rate for callus is 9.0%.The germination rate for axillary buds is 30.3%while formation rate for callus is 51.5%.And formation rate for callus of internodal stems without buds is 45.2%.That is to say,germination rate of terminal buds is higher than that of axillary buds.The browning rate for explant is closely related to inoculative time.Low degree of browning would be achieved while inoculated at that very day to culture in vitro.

Danshui pear;explant;stems;browning

S 661.2

：A

：1007-6883（2016）06-0045-04

责任编辑 朱本华 周春娟

2016-08-31

广东省科技计划项目（项目编号：2013B020304010）；惠州市科技计划项目（项目编号：2013B040009001）.

宋冠华（1969-），男，广东紫金人，惠州学院生命科学学院实验师；曾令达为通讯作者.