土壤微生物中荚膜菌的分离与培养

冯 航

(西安文理学院 生物与环境工程学院，西安 710065)

土壤微生物中荚膜菌的分离与培养

冯 航

(西安文理学院 生物与环境工程学院，西安 710065)

荚膜是细菌的特殊结构，也是微生物实验中需要观察的基本形态结构.但是具有荚膜的细菌较少，来源困难.近年来，从土壤微生物中分离、培养出具有荚膜的细菌，用于学生实验，取得了良好的教学效果.

细菌；荚膜；分离和培养

在一些种类的细菌中，能分泌一种黏性物质于细胞壁的表面，完全包围并封住细胞壁，使细菌和外界环境有明显的边缘，这层黏性物质称为荚膜(capsule).其成分为多糖、糖蛋白或多肽.碳氮比高和强的通气条件有利于好氧细菌形成荚膜.荚膜是细菌分类的依据之一.荚膜对细菌具有保护功能，在营养缺乏时，荚膜可以为细菌提供能量来源.在废水处理过程中，荚膜能够将废水中的化合物吸附在细胞表面，有利于对其吸收降解[1-2].

荚膜是细菌的特殊结构，也是微生物实验中需要观察的基本形态结构，但是具有荚膜的细菌较少，来源困难[3].近年来，我们从土壤微生物中分离、培养出具有荚膜的细菌，用于学生实验，取得了良好的教学效果.

1 仪器与材料

1.1 仪器与用具

超净工作台、培养箱、高压灭菌锅、无菌涂布棒、试管、培养皿、接种环、移液器.

1.2 药品与材料

可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4、MgSO4、FeSO4、琼脂粉、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、KH2PO4、孟加拉红、苯酚、链霉素、甲基紫、装有无菌水且带有玻璃珠的三角瓶、土样.

2 实验方法

2.1 培养基的制备

高氏Ⅰ号培养基：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl 0.5g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，琼脂20g，水1000mL，pH 7.2～7.4，121℃灭菌20min.

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15g，水1000mL，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min.

马丁氏培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g,MgSO4·7H2O 0.5g，1/3000孟加拉红 100mL，琼脂15g，水800mL，pH自然，121℃灭菌20min[4].

2.2 倒平板

将上述3种培养基加热溶化，待冷却至50℃左右时，分别向高氏Ⅰ号培养基中加入数滴质量浓度10%的苯酚，马丁氏培养基中加入一定量的链霉素溶液，混匀后倒平板，冷却后待用.每个实验组平行3份.

2.3 土壤稀释液的制备

随机选取校园3个土壤采集点，分别取地表2cm以下的土壤适量，充分混匀后称取10g土样，放入盛有90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振摇数分钟，使土样与水充分混合，将细胞分散.无菌吸取1mL土壤菌液加入盛有9mL无菌水的试管中，震荡均匀.然后从此试管无菌吸取1mL菌液加入另一盛有9mL无菌水的试管中，震荡均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤稀释液[4-5].

2.4 菌液涂布

分别将10-4、10-5、10-6的土壤稀释液无菌吸取0.1mL，加入不同的平板中，均匀涂布在培养基表面，室温静置10min，使菌液吸附进培养基.28℃倒置培养，每天观察菌落生长情况.

3 结果

3.1 荚膜菌的分离

涂布的不同稀释度的土壤菌液经培养后观察，5～7d，3种培养基中生长的土壤微生物种类较多，有细菌、霉菌、放线菌等.进一步观察后发现，高氏Ⅰ号培养基培养的土壤微生物平板中，稀释度为10-5的土壤稀释液经平板培养后获得的荚膜菌落较多，可以进一步分离培养.

将平板上长出的透明的、凸起的、光滑的、黏液状或胶质状的单菌落逐一圈起来，结果见图1，这些菌落特点和荚膜菌的特点相似度很高，可以分别镜检进行判断.

3.2 荚膜菌的观察

取乙醇浸泡干净的载玻片，在其一端滴一滴质量浓度6%的葡萄糖溶液，无菌操作分别挑取平板上标记的单菌落1环，混匀在葡萄糖溶液中，再滴加一滴绘图墨水使其与之充分混合.另取一载玻片，将其一端与混合液接触，轻轻左右移动，使混合液沿推片散开，然后以30°角迅速推向另一端，使混合液在载玻片上形成薄膜.自然干燥后加甲醇覆盖载玻片固定1min,倾去甲醇，自然干燥载玻片.滴加1%甲基紫水溶液染色1～2min，用自来水缓慢冲洗，自然干燥后镜检.背景灰色，菌体紫色，菌体周围的清晰透明圈为荚膜[4-7].

3.3 荚膜菌的培养

将镜检后确认为荚膜菌的单菌落标记出来，无菌操作条件下挑取少许，划线接种在高氏Ⅰ号斜面培养基中，28℃培养2d，结果见图2，由此便可从土壤微生物中分离出荚膜菌，通过斜面扩大培养后用于学生进行细菌的荚膜染色实验，效果良好.

图1 土壤稀释液涂布平板

图2 荚膜菌单菌落斜面培养物

4 讨论

实验中我们将不同稀释度的土壤菌液分别接种在牛肉膏蛋白胨培养基、马丁氏培养基、高氏Ⅰ号培养基3种培养基中，28℃倒置培养后观察结果，发现只有高氏Ⅰ号培养基上稀释度为10-5(体积比)的土壤菌液涂布平板上长有大量荚膜菌，而且单菌落较多，选择从此培养基上选取荚膜菌单菌落进行镜检，并扩大培养.高氏Ⅰ号培养基也被确定为适合荚膜菌生长的培养基.

分析3种培养基的成分，三者之间都存在一定的差异性，因此这3种培养基上分离培养出的菌落也存在一定的差别.实验发现高氏Ⅰ号培养基上长出的荚膜菌落最多，而高氏Ⅰ号培养基较其他两种培养基属于无氮培养基，因此我们推测荚膜菌更有利于在无氮培养基上生长.

荚膜菌在培养基上培养时间较长后，荚膜的特征会逐渐减弱甚至消失，因此在实验过程中要新鲜培养，最好在培养7d以内观察.

[1] 乐毅全，王士芬.环境微生物学(第2版)[M].北京：化学工业出版社，2013:27-28.

[2] 沈萍，陈向东.微生物学实验(第4版)[M].北京：高等教育出版社，2012:77-79.

[3] 包东武.从土壤中分离产气荚膜杆菌用于实验教学[J].卫生职业教育，2004,22(8)：93-94.

[4] 沈萍，范秀荣，李广武.微生物学实验(第3版)[M].北京：高等教育出版社，1999:70-73.

[5] 李宏.用硅酸盐培养基分离荚膜菌[J].生物学通报，1995,30(2)：39-40.

[6] 赵福春.细菌荚膜染色新法两则[J].生物学杂志，1994，59(3)：35-36.

[7] 刘支梅.细菌荚膜的培养及染色[J].生物学通报，1989(6)：34-35.

[责任编辑 马云彤]

Isolation and Culture of Capsule Bacteria in Soil Microorganism

FENG Hang

(School of Biological and Environmental Engineering, Xi’an University, Xi’an 710065, China)

The capsule is a special structure of bacteria, and it is also the basic morphological structure that needs to be observed in the experiment of microbiology. But the bacteria with capsule is less, and it is hard to get. In recent years, we have isolated the bacteria with capsule from soil microorganisms for students’ experiment, and achieved good teaching results.

bacteria; capsule; isolation and culture

1008-5564(2016)05-0060-03

2016-06-02

冯 航(1982—)，女，陕西西安人，西安文理学院生物与环境工程学院实验师，主要从事天然产物开发与利用研究.

Q93-335

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