补肾益冲抗衰汤对卵巢储备功能下降大鼠血清AMH和INHB的影响

朱程芬邱晓晓帅 军程 泾程 蕾朱长玲

补肾益冲抗衰汤对卵巢储备功能下降大鼠血清AMH和INHB的影响

朱程芬1邱晓晓1帅 军2程 泾1程 蕾1朱长玲2

目的观察补肾益冲抗衰汤对卵巢储备功能下降模型大鼠血清内分泌及抗苗勒管激素（AMH）、抑制素B（INHB）的影响。方法选取40只8周龄雌性SD大鼠，分为正常对照组、模型组、补佳乐组、补肾益冲抗衰汤组，各10只，除正常对照组外，其余各组采用雷公藤多苷片+相应药物制作卵巢储备功能下降大鼠模型。通过阴道涂片观察各组大鼠动情周期，光镜下观察卵巢组织形态学变化，酶联免疫法检测血雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、AMH、INHB水平。结果补肾益冲抗衰汤能维持大鼠动情周期4～5天，促进卵泡发育成熟、改善内分泌水平，与模型组比较，E2上升[（21.51±1.26）pg/mL比（9.81±1.18）pg/mL，P＜0.05]，FSH下降[（6.57±1.88）mIU/ mL比（9.59±2.17）mIU/mL，P＜0.05]，FSH/LH降低[（2.27±0.44）比（3.36±0.82），P＜0.05]；升高AMH[（114.45±11.11）ng/L比（100.27±9.17）ng/L，P＜0.05]和INHB[（56.91±1.74）ng/L比（26.28±6.19）ng/L，P＜0.05]水平。结论补肾益冲抗衰汤能够改善卵巢储备功能下降（DOR）大鼠性激素水平，升高AMH、INHB水平，并减少闭锁卵泡，改善大鼠卵巢储备功能。

大鼠；卵巢储备功能下降；补肾益冲抗衰汤；抗苗勒管激素；抑制素B

卵巢储备功能下降（DOR）是近年来新发现并命名的女性生殖内分泌疾病，是指卵巢卵泡池内可募集卵泡数目减少，卵母细胞质量下降，导致女性生育能力降低及性激素缺乏。因DOR可进一步发展为卵巢早衰（POF）,故早期诊断并给予合理的治疗，可使卵巢储备功能得到改善，提高妊娠率，延缓卵巢早衰[1]。近年研究显示，血清基础AMH和INHB水平与卵巢储备功能密切相关，是目前有价值的预测DOR指标[2]。中医虽无DOR的病名，但根据症状，该病属中医“闭经”、“血枯”、“不孕”、“断经前后诸症”等范畴，病因病机为肾虚夹瘀、火、痰等本虚标实。补肾益冲抗衰汤是程泾教授治疗卵巢储备功能下降的经验方，笔者制作了DOR大鼠模型对比分析该方对卵巢储备功能下降大鼠血清AMH、INHB等水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雌性SD大鼠40只，动物许可证号：SYXK（浙2010-0150）体质量170～220g，SPF级，8周龄,温州医学院实验动物中心提供和饲养。于温州医学院动物实验中心SPF级屏障动物实验区饲养。大鼠分笼饲养，每笼5只，自由饮水，自由饮食，常规全价饲料喂养，室温20～22℃，通过自动换气装置调节室内空气，人工调节荧光照明，每天明暗各12h。

1.2 药品与试剂 雷公藤多苷片（普洛康裕）：10mg/片。补肾益冲抗衰汤（由温州中山医院提供、制备）：由菟丝子、淫羊藿、巴戟天、龟甲、太子参、当归、熟地枸杞子、鹿角片、牛膝、丹参、灵芝、怀山药、茺蔚子、知母、黄柏等组成。每毫升含生药1g。黄体酮胶囊（爱生药业）：100mg/粒。补佳乐（拜耳医药）：1mg/片。左归丸（宛西制药）：45g/瓶。AMH、INHB ELISA试剂盒：购自R&D公司,批号E-30082；E2酶免试剂盒：美国R&D公司，批号E-30606；LH酶免试剂盒：美国R&D公司，批号E-30621；FSH酶免试剂盒：美国R&D公司，批号E-30595。

1.3 动物分组与给药 健康雌性SD大鼠适应性喂养1周后，进行阴道细胞学涂片，筛选出有正常动情周期的大鼠40只，数字随机表法随机分为正常对照组10只，9时/16时均予生理盐水；模型组10只，9时予雷公藤多苷片50mg/kg，16时予生理盐水；补佳乐组10只，9时予雷公藤多苷片50mg/kg，补佳乐0.24mg（/kg·d），第4天加用黄体酮胶囊25mg（/kg· d），两药同时停用1天后重复下个疗程；补肾益冲抗衰汤组10只，9时予雷公藤多苷片50mg/kg，补肾益冲抗衰汤48mg/（kg·d）；各组均连续给药3周。

1.4 标本制备与指标检测 （1）用药结束后连续5天阴道涂片：将生理盐水浸湿的棉签轻轻插入大鼠阴道内旋转后取出、涂片，置于95%乙醇固定20min 后HE染色，光镜下观察阴道上皮脱落细胞变化情况，观察动情周期变化。（2）将处于动情前期或第5天尚未出现明显动情周期的大鼠快速处死，心脏取血3mL，置于PE管中，3000r/min离心10min，分离血清，-20℃保存，ELISA法检测性激素FSH、LH、E2及血清AMH、INHB。（3）快速取出双侧卵巢并剔除脂肪组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片。HE染色，光镜下观察各级卵泡、黄体、颗粒细胞（GC）、间质等变化。

1.5 统计学方法 所有数据进行正态性检验，用均数±标准差（±s） 表示。应用SPSS17.0统计软件，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）、Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。方差齐性者两两比较采用LSD法，方差不齐者采用Dunnet，sT3检验。

2 实验结果

2.1 对大鼠动情周期的影响 正常对照组大鼠维持原有的动情周期4～5天。模型组大鼠动情周期在给药1周后延长为7～8天1次，间情期3～5天。每天1次阴道脱落细胞涂片观察，不见动情前期。补佳乐组大鼠性周期不规则，动情前期、动情期稍延长2～5天，或持续为动情前期、动情期。补肾益冲抗衰汤组大鼠性周期规则，性周期为4～5天，每天1次阴道脱落细胞涂片观察到动情前期，动情后期、间情期较模型组缩短约2～3天。

2.2 对大鼠卵巢形态学的影响 正常对照组大鼠卵巢体积大，可见各级卵泡，卵泡生长活跃，形态规则圆润，颗粒细胞层次多，卵泡液含量多，卵泡饱满；黄体发育好，体积大，黄体细胞丰富；偶见闭锁卵泡。模型组大鼠卵巢体积萎缩，被皮增厚，色苍白，各期卵泡数均明显减少，趋于闭锁卵泡较多，颗粒细胞层次少，黄体偏小；间质可见炎细胞浸润及纤维化。补佳乐组、补肾益冲抗衰汤组大鼠卵巢颜色粉红，血供丰富，体积、卵泡、黄体与正常对照组无明显差异，可见各级生长卵泡和较多成熟卵泡，卵泡液丰富，黄体成熟，体积较大。

2.3 对DOR大鼠血清FSH、FSH/LH、E2的影响（1）血清E2：各组大鼠血清E2较正常对照组明显降低（P＜0.05）；补佳乐组、补肾益冲抗衰汤组E2较模型组明显增高（P＜0.05），补佳乐组优于补肾益冲抗衰汤组（P＜0.05）。（2）血清FSH：模型组较正常对照组明显增高（P＜0.05）；补佳乐组、补肾益冲抗衰汤组FSH较模型组明显降低（P＜0.05），补佳乐组、补肾益冲抗衰汤组间无明显差异（P＞0.05）。（3）FSH/LH：模型组较正常对照组明显增高（P＜0.05）；补佳乐组、补肾益冲抗衰汤组FSH/LH比值较模型组明显降低（P＜0.05），补佳乐组、补肾益冲抗衰汤组间无明显差异（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清FSH、FSH/LH、E2变化（±s）

表1 各组大鼠血清FSH、FSH/LH、E2变化（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与补佳乐组比较，#P＜0.05；E2：雌二醇；FSH：卵泡刺激素；LH：黄体生成素

组别正常对照组模型组补佳乐组补肾益冲抗衰汤组鼠数10 10 10 10 E2（pg/mL）46.08±1.69 9.81±1.18* 37.34±1.69*△21.51±1.26*△#FSH（mIU/mL）4.64±2.16 9.59±2.17* 6.89±2.86*△6.57±1.88*△FSH/LH 1.80±0.76 3.36±0.82* 2.14±0.57△2.27±0.44△

2.4 对DOR大鼠血清抗苗勒管激素（AMH）、抑制素B（INHB）的影响 与正常对照组比较，各组大鼠血清AMH均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，补佳乐组、补肾益冲抗衰汤组大鼠血清AMH水平明显增高（P＜0.05）；与补佳乐组比较，补肾益冲抗衰汤组大鼠血清AMH水平明显增高（均P＜0.05）。与正常对照组比较，模型组INHB水平明显降低（P＜0.05）；补佳乐组、补肾益冲抗衰汤组INHB水平明显高于模型组（P＜0.05）；补佳乐组、补肾益冲抗衰汤组间无显著差异（P＞0.05）。

表2 各组大鼠血清抗苗勒管激素、抑制素B水平比较（ng/L±s）

表2 各组大鼠血清抗苗勒管激素、抑制素B水平比较（ng/L±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与补佳乐组比较，#P＜0.05

3 讨 论

育龄妇女长期服用雷公藤（tripterygium wilfordii hook.f）可造成卵巢功能减退或衰竭[3]。有研究[4]发现雷公藤对动物卵巢损害的病理结果与人类更为一致（卵巢组织病理学发现卵巢萎缩，各级卵泡减少，间质增加，淋巴细胞浸润等）。我们采用雷公藤多苷片灌胃制造卵巢储备功能下降的大鼠模型，发现模型组大鼠毛发稀疏，无光泽，动情周期延长；卵巢萎缩，形态改变，色苍白，卵巢内各期卵泡数减少，闭锁卵泡增多；黄体脂肪变性；间质纤维化；血清FSH、FSH/ LH增高，E2降低[5-6]。模型大鼠表现出与人类DOR相似的一系列改变。因此可以肯定雷公藤可以制造出与人类病理结果相近的DOR模型。

AMH由窦前卵泡和小窦卵泡的颗粒细胞分泌，有抑制卵泡生长，防止卵泡过快过早耗尽的作用。当原始卵泡募集进入初级卵泡后，卵泡进入对FSH敏感的窦前卵泡时期，FSH刺激卵泡不断生长，在AMH基因缺失小鼠中发现，低FSH水平下AMH基因缺失小鼠比对照组有更多的生长卵泡[7]，说明AMH通过降低卵泡对FSH的敏感性而抑制FSH诱导的卵泡生长，从而控制大量窦前或小窦卵泡继续生长为优势卵泡。近年研究者分别观察了高度刺激和自然周期下的卵泡液，发现AMH是卵母细胞和卵泡发育潜能的标记物[8]，并可作为卵巢储备的定性标记。有研究显示随着年龄增加，卵巢激素最早变化的是AMH，在女性出生时，外周血几乎测不到AMH，性成熟后达最高水平，30岁后开始下降[9]，直至绝经期消失。La Marca等[10]研究证明，AMH在整个月经周期的波动极小，呈相对稳定状态。这意味着临床上可以在月经周期的任一时期取血检测AMH水平，从而取消对不孕患者月经周期的限制。因此，AMH可以作为预测卵巢年龄的标志物，更好地反映卵巢的储备功能。

INHB由卵巢颗粒细胞分泌，对生殖内分泌起调节作用，INHB可以反馈抑制垂体合成分泌FSH，并抑制促性腺激素释放激素对自身受体的调节作用，还可以通过自分泌/旁分泌调节E2的产生[11]。通过对DOR患者的基因测序也发现，INHB基因的多态性与DOR的发生密切相关并且血清INHB水平下降是较E2水平下降的一个更早期的事件。因此INHB 和FSH、E2一样可以反映卵巢的功能状态并可能成为反映卵巢功能衰退的更敏感的指标。

中医认为，肾虚是卵巢功能减退的主要病因病机，血虚、血瘀为该病的主要环节，此外亦包括情志因素、生活因素和体质因素等[12]。肾为先天之本，主藏精气，肾中精气（阴、阳）的盛衰，主宰着人体的生长发育及生殖功能的成熟和衰退，故肾中精气充盛，天癸成熟，月经来潮而有子，标志着女性卵巢生殖周期活动的开始；肾中精气衰退，天癸耗竭，月经闭绝，提示女性卵巢生殖功能的结束。张吟等[13]也认为DOR病机以肾气不足，肾精亏虚为基础。肝气郁结，血行不畅,或气血不足，冲任不充，血海空虚，胞宫失养，是该病发生的重要条件。

补肾益冲抗衰汤临床主要用于肾虚、气血不足、冲任失养之月经稀少、闭经、不孕者，即因DOR引起的月经失调等内分泌紊乱疾病，有补肾阴肾阳，调冲任，养血化瘀之功效，方中巴戟天、菟丝子、淫羊藿、鹿角片温补肾阳是为君药；臣知母、黄柏滋肾阴、泻肾火；佐熟地、枸杞子补肾养阴；龟板、鹿角片等血肉有情之品，阴阳共补，意在阴中求阳，阳中求阴，补肾调冲抑亢；更用灵芝补气血，抗衰老，山药、太子参健脾（胃）补肾，意在养心益肾补后天而益先天；当归、丹参、牛膝、茺蔚子活血和血调经。以上各药合用，使肾气肾精充盈，冲任气血调和，脏腑平衡则月经如期而至，精卵结合，孕育成胎。有学者对单味中药进行深入研究发现菟丝子、枸杞子等具有雌激素样活性[14-15]，能促进下丘脑—垂体促性腺功能，提高垂体对促性腺激素释放激素的反应性，增强卵巢功能，改善神经内分泌的调节，具有诱发排卵作用。藉此推测补肾益冲抗衰汤不仅在宏观整体上进行辨证调节，也使微观局部功能得以改善。进而阐释了本实验中模型大鼠服用补肾益冲抗衰汤后卵巢组织中卵泡数目增多、血AMH、INHB水平升高、FSH、LH、E2得到改善的原因。卵泡数目增多，窦卵泡和窦前卵泡分泌AMH增多，降低了卵泡对FSH的敏感性，减少卵泡的过早耗尽；成熟卵泡增多，颗粒细胞分泌INHB增多，INHB反馈抑制垂体合成分泌FSH，增加E2合成，抑制促性腺激素释放激素对自身受体的调节作用，保护卵巢功能，提高卵巢的储备功能。本研究结果为临床治疗卵巢储备功能下降提供了理论依据和新思路。

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（收稿：2015-10-08 修回：2016-01-11）

Influence of Bushen Yichong Kangshuai Decoction on AMH and INHB of Rats with Diminished OvarianReverse

ZHU Chengfen1,QIU Xiaoxiao1,SHUAI Jun2,CHENG Jing1,CHENG Lei1,ZHU Changling2. 1 Department of Infertility,Wenzhou Zhongshan Hospital,Wenzhou 325000,China;2 Department of Gynecology&Obstetrics,the First Affiliated Hospital of Ningbo University,Ningbo 315000,China

ObjectiveTo observe the influence of Bushen Yichong Kangshuai Decoction（BSYCKSD）on endocrine and anti-Mullerian（AMH）and inhibin B（INHB）expressions of diminished ovarian reserve model rats.MethodsEight-week old 40 healthy female rats as the research object were divided into normal control group, model group,prognova group,BSYCKSD group,with 10 rats in each group.Except for normal control group,tripterygium wilfordii and corresponding medicinewere used to set up diminished ovarian reserve model in rats.The estrous cycle was determined through the observation of vaginal smear.The morphological changes of ovarian tissue was observed by light microscopic.ELISA method was for measuring serum estradiol（E2）,follicle stimulating hormone （FSH）,luteinizing hormone（LH）,AMH and INHB.ResultsIn BSYCKSD group,the estrous cycle of rats lasted 4 to 5d,the development of mature follicles was promoted,and the endocrine levelswas improved compared with model group（E2：21.51±1.26pg/mL vs 9.81±1.18pg/mL;FSH：6.57±1.88mIU/mL vs 9.59±2.17mIU/mL;FSH/LH：2.27±0.44 vs 3.36±0.82;all P＜0.05）and the levels of AMH（114.45±11.11 ng/L vs 100.27±9.17ng/L，P＜0.05）and INHB（56.91±1.74ng/L vs 26.28±6.19ng/L，P＜0.05）were increased.ConclusionBSYCKSD can improve sex hormone levels in rats with diminished ovarian reserve,increase the level of AMH and INHB,and reduce the follicular atresia,resulting in enhancing the reserve function of ovary.

rats;diminished ovarian reserve;Bushen Yichong Kangshuai Decoction;anti-Mullerian;inhibin B

浙江省中医药科技计划项目（No.2011ZB143）；浙江省温州市医药卫生科学研究项目（No.2011B053）；浙江省温州市鹿城区科技计划项目（No.Y12003）

1浙江省温州中山医院不孕不育科（温州325000）；2宁波大学医学院附属医院妇产科（宁波 315000）

朱长玲，Tel：18858033268；E-mail：1208302530@qq.com