软骨组织工程种子细胞源的研究进展

丛 波　综述　张仲文　审校



软骨组织工程种子细胞源的研究进展

丛 波综述张仲文审校

【摘要】关节软骨缺损的发病率较高，患者生活质量受到严重影响，传统治疗方式疗效不理想。组织工程技术在临床应用方面进行了初步尝试，为临床软骨缺损修复提供了新的思路与途径。现就组织工程种子细胞的研究进展进行综述。

【关键词】软骨；组织工程；种子细胞

关节软骨没有血管、神经及淋巴组织，一旦损伤后自我修复能力十分有限［1］。软骨损伤的发病率较高，在运动员等特殊人群中发病率更高，以往的关节镜清理术、微骨折术等手术方式效果并不理想［2］，术后软骨缺损区尚无软骨生成或仅能生成纤维软骨，不能彻底修复软骨缺损。自“组织工程”的概念问世以来，学者们一直在尝试用各种组织工程方法修复软骨缺损，组织工程的研究范畴主要包括种子细胞、支架材料和细胞因子，然而，不同的种子细胞在表型和增殖能力等方面都有差异，种子细胞的选择对组织工程的研究至关重要。笔者主要对软骨组织工程种子细胞源的研究进展进行综述。

1　取材要求及临床应用

组织工程的种子细胞源应符合以下要求：（1）来源广泛，取材方便；（2）增殖能力强；（3）表型稳定；（4）与支架材料的黏附率高；（5）对供区的损伤小；（6）无明显免疫排斥反应，生物安全性高；（7）植入体内后能有效地修复关节软骨缺损，并且有明确的远期疗效。目前，软骨组织工程技术在各个领域已得到广泛应用［3］，如软骨细胞移植可应用于关节软骨修复、气管软骨修复、耳廓的重建、骨不连的治疗等领域；骨髓间充质干细胞可用于修复软骨缺损，治疗肌腱、韧带、椎间盘、半月板等结缔组织的损伤，还可防止关节软骨的退行性变发生，将外源基因导入骨髓间充质干细胞可有效地表达，从而达到治疗相应疾病的目的。国外已初步对组织工程修复软骨缺损进行了探索，但缺乏大样本及长期随访研究，且对治疗效果的评估缺乏统一的客观标准［3］。在软骨组织工程的应用过程中，生物反应器技术可使组织均匀混合，精确控制基质的生成比例，有利于保持组织的活性，近年应用较多的生物反应器有机械搅拌式生物反应器、微载体生物反应器、灌注式生物反应器、旋转式微重力生物反应器。

2　种类

2.1软骨细胞 软骨细胞因取材方便、免疫排斥反应小等优点是软骨组织工程种子细胞的重要来源［4］。按照软骨种子细胞的不同来源又可细分为自体软骨细胞、异种软骨细胞及同种异体软骨细胞。因异种软骨细胞虽来源广泛，但免疫原性较强，应用较少，故不作详细论述。

2.1.1自体软骨细胞 从患者体内获得软骨组织后，可通过胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶获得大量纯度较高的自体软骨细胞。有学者研究表明自体软骨细胞移植技术修复软骨缺损疗效满意，术后对新生软骨行组织切片检查证实新生软骨为透明软骨［5，6］。软骨细胞来源于自体，不存在免疫排斥，但是自体软骨细胞来源较为局限，增殖能力低下。膝关节软骨缺损的患者进行软骨细胞移植手术前，需从膝关节非负重区获取健康的关节软骨体外消化培养，这就增加了供区术后疼痛和骨性关节炎的发生率。在体外实验过程中发现软骨细胞传至3代以后生长缓慢，会失去原有的形状，细胞表型发生改变，发生去分化。3代之前软骨细胞特异性表达Ⅱ型胶原，3代以后转为表达Ⅰ型和Ⅲ型胶原，蛋白多糖分泌减少，成软骨能力减弱。随着年龄增长会导致软骨细胞活性逐渐下降，自体软骨细胞移植不太适合年龄较大的患者，这也是自体软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的局限所在，然而软骨细胞在体外培养的过程中，接种密度较低容易发生去分化，而在接种密度高细胞培养时就不存在这一问题［7］。Robinson等［8］认为，软骨细胞在聚集培养的过程中，分泌的生长因子在局部积聚，并且细胞和细胞基质不断地进行信号传导，有利于维持和恢复细胞表型。因此，在软骨细胞体外培养的过程中，接种密度不应过低。生物反应器通过控制培养环境的pH、营养等，模拟细胞在体内生长的微环境，为细胞生长提供适宜的条件。软骨细胞在生物反应器内进行三维培养时可快速扩增，从而可获得表型稳定的永生化软骨细胞。

2.1.2同种异体软骨细胞 关节软骨由软骨细胞和细胞外基质组成，软骨细胞存在于细胞外基质形成的软骨陷窝中，可阻挡免疫细胞的攻击，故同种异体软骨细胞进行移植时免疫反应较轻微。并且，软骨细胞在体外培养的过程中经过酶消化等步骤后，抗原被处理，免疫原性降低。即使严重的免疫排斥反应也可通过免疫抑制剂消除。同种异体软骨细胞来源较广，关节软骨、肋软骨及耳软骨等均可作为其来源。一次消化可获得充足的软骨细胞，可有效解决细胞来源不足的问题。国外已有学者报道过同种异体软骨细胞移植在修复兔关节软骨缺损方面取得了满意的疗效［9］。但是同种异体软骨细胞移植有可能传播疾病，并且在获取的过程中对供体也造成一定伤害。

2.2骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）BMSCs来源于中胚层，存在于骨髓中，具有高度自我更新和多向分化的能力［10］。BMSCs因来源广泛、分化能力强越来越受到学者们的重视。Kurod等［11］研究显示，自体BMSCs移植不存在免疫排斥反应，为安全的种子细胞来源。分离BMSCs的办法也比较多，最常用的是密度梯度离心法和贴壁分离法。密度梯度离心法获得的原代细胞纯度高，但细胞活性低，贴壁数量少；贴壁分离法可通过换液去除杂质和不贴壁的细胞，获得的细胞纯度较高。BMSCs有向骨、软骨、脂肪分化的能力，包含血小板衍生生长因子、β转化生长因子、碱性成纤维细胞生长因子-2、表皮细胞生长因子等多种细胞因子均可诱导BMSCs向软骨细胞分化［12］。为确定获得的细胞确实为BMSCs而非其它成纤维样细胞，需使用流式细胞仪对其进行鉴定。CD44、CD90、CD105是鉴定BMSCs的阳性表面标志，CD34、CD45为阴性表面标志［13］。阳性表面标志和阴性表面标志的百分比与细胞的纯度呈正比。虽然BMSCs的增殖能力和分化能力较强，但其数量较少，仅占全骨髓的1/105～1/104。BMSCs对分化成软骨细胞所需的诱导条件要求较高，但也有研究表明重度骨性关节炎患者BMSCs的成软骨能力明显减弱［14］。BMSCs传代至90代后可发生癌变，故对其作为软骨组织工程的种子细胞来源应保持警惕。

2.3脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）ADSCs同样来自于中胚层，具有多向分化潜能，并且有免疫抑制作用［15］。ADSCs在含地塞米松、维生素、胰岛素等组成的成软骨诱导液分化后，可分化为软骨细胞。因CD49在ADSCs中阳性表达，CD106阴性表达，CD34为低水平表达，可据此对ADSCs进行鉴定［16］。ADSCs来源广泛，取材方便，对供体损伤较小，并且细胞含量丰富，ADSCs的粘附与增殖能力与供者的年龄无关，仅与体质有关，是比较理想的种子细胞来源［17］。但Winter等［18］研究发现，ADSCs与BMSCs相比成软骨能力要弱。ADSCs在三维培养环境中高密度培养进行成软骨诱导时可形成软骨细胞，在单层培养环境中进行成软骨诱导则成软骨失败。因此，在ADSCs应用于软骨组织工程方面还需要进一步的研究。2.4 胚胎干细胞 胚胎干细胞具有分化为三胚层的潜能，在适当的条件下可分化为所有组织器官类型的细胞。目前已经有研究证实胚胎干细胞可在支架材料中进行生长、扩增和分化［19］。Kramer等［20］研究表明骨形态发生蛋白-2和骨形态发生蛋白-4能促进胚胎干细胞向软骨细胞分化。与软骨细胞相比，胚胎干细胞具有很强的再生能力和分化潜能，能很好地完成细胞的更新，这是其作为软骨组织工程种子细胞的优势。但是目前胚胎干细胞用于临床治疗尚存在伦理学问题，本身具有致瘤性和免疫原性，并且体外培养条件要求严格，这就限制了胚胎干细胞在软骨组织工程中的进一步应用。

2.5脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）脐带连于胚胎脐部与胎盘间，从中可分离出UCMSCs，并且成功率很高［21］。UCMSCs在体外培养时贴壁生长，具有成纤维细胞的形态。UCMSCs除表达间充质干细胞的表面标志外，还表达胚胎转录因子Nanog等更原始的表面分子［22］。酶消化法和组织块培养法是目前消化分离UCMSCs的主要方法，酶消化法的缺点在于有可能损伤细胞并破坏细胞表面标志［23］。组织块培养法虽简单可控，但培养时间较长，组织块贴壁不牢固并且容易污染。Deans等［24］研究发现UCMSCs可不被同种异体T细胞识别和排斥，不会发生免疫排斥反应。软骨诱导培养液对UCMSCs进行诱导培养后，细胞会分泌较多的的Ⅱ型胶原。另外，脐带中富含透明质酸、糖胺聚糖以及胶原，是透明软骨的重要细胞外基质，与天然软骨的细胞外成分极为相似。并且，脐带属于废弃物，来源较为广泛，价格低廉，不存在伦理问题。因此，人脐带间充质干细胞很有可能会成为未来软骨组织工程研究的重点。

2.6滑膜间充质干细胞（synovium-derived mesenchymal stem cells，SMSCs）自从2001年成功分离出SMSCs以来，学者们对它的研究就从未停止过。SMSCs来源于关节囊的内层（滑膜层），属于间叶细胞。酶消化法和组织块接种法均可成功分离SMSCs。SMSCs在体外培养时既有圆形的巨噬样细胞，也有纺锤形的成纤维样细胞。培养初期两种细胞混合存在，但成纤维样细胞增殖的速度要比巨噬样细胞快得多，当细胞融合至90％以后，视野中几乎全为成纤维样细胞。滑膜间充质干细胞的增殖能力比骨髓间充质干细胞高［25］。流式细胞仪检测SMSCs表达CD44、CD90，不表达CD34、CD45［26，27］。SMSCs不表达Ⅱ类组织相容性抗原RLADQ，其免疫原性较低，不会或很少发生免疫排斥反应。因此SMSCs可用于同种异体移植，为组织工程的研究带来了一线生机［28］。并且SMSCs是正常的二倍体细胞，无致瘤性，安全可靠，与BMSCs基因谱相比，SMSCs基因谱与软骨细胞基因谱更为接近［29］。Dry等［30］进行的一项研究表明Ca2+可促进SMSCs增殖，高峰出现在Ca2+浓度为5.0 mmol/L时，可以通过适当补充Ca2+以加速SMSCs增殖；而与胎牛血清相比，人血清也能加速SMSCs增殖。

2.7基因修饰后的细胞 基因修饰可通过转染等技术将目的基因导入靶细胞，使其表达转化生长因子等达到修复组织缺损的目的。该技术在骨髓间充质干细胞中应用的最为广泛。软骨细胞转染后生存率较高，毒性小，长期培养过程中分化成软骨的能力没有变化。

将BMP-2和BMP-4转入胚胎干细胞内以后，胚胎干细胞可向软骨细胞分化。并且，基因修饰后的软骨细胞有很强的生物学功能，可很好地解决自体软骨细胞供量不足的问题，缩短体外培养时间，维持软骨细胞的表型。包括腺病毒、逆转录病毒、脂质体在内的多种载体均可成功转染软骨细胞。但是，Seo等［31］发现转染的目的基因可以破坏宿主本身的基因结构，而且目的基因表达的生长因子长期过多表达会对靶细胞带来改变。不仅如此，转染后的细胞分泌的糖胺聚糖和Ⅱ型胶原的量会减少，这就限制了该技术的进一步应用。故该技术的安全性和可靠性仍需进一步的研究证实。

自“组织工程”的概念提出以来，学者们一直在寻找合适的细胞作为种子细胞。随着学者们研究的不断深入，软骨细胞、BMSCs、ADSCs等种子细胞逐渐应用于组织工程中。然而，每一类种子细胞都有其自身的优缺点。因此，还需要后续的进一步研究来探讨各类种子细胞的特点，并积极寻找新型种子细胞以扩充组织工程的种子细胞库。种子细胞筛选、培养和组织构建的规范化及安全性评价将是今后的研究方向，当组织工程真正应用于临床，将能解决较多难题。

【参考文献】

［1］李志鸿，李 煜，李素梅.骨软骨组织工程的研究进展［J］.医药前沿，2015，5（9）：72-73.

［2］吕 顺，周军杰，谢晓涛.软骨组织工程种子细胞获取培养及鉴定研究进展［J］.中国骨与关节杂志，2015，4（11）：864-867.

［3］张莹莹，周广东，曹谊林.软骨组织工程的研究进展［J］.组织工程与重建外科杂志，2011，7（6）：340-343.

［4］张世浩，朱立新.关节软骨组织工程种子细胞的研究进展［J］.中国修复重建外科杂志，2008，22（12）：1505-1507.

［5］Zhang Z，Zhong X，Ji H，et al.Matrix-induced autologous chondrocyte implantation for the treatment of chondral defects of the knees in Chinese patients［J］.Drug Design Devel Ther，2014，8（5）：2439-2448.

［6］张仲文，侯世科，杨造成.基质诱导的自体软骨细胞移植术修复膝关节软骨缺损10 例术后2年的随访［J］.中华关节外科杂志，2010，4（6）：734-741.

［7］丛 波，张加廷，韩 龙.兔软骨细胞的分离及其与Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜共培养实验研究［J］.中国现代医学杂志，2016，26（7）：4-8.

［8］Robinson D，Ash H，Yayon A，et al.Characteristics of cartilage biopsies used for autologous chondrocytes transplantation［J］.Cell Transplant，2001，10（2）：203-208.

［9］Boopalan P R，Sathishkumar S，Kumar S，et al.Rabbit articular cartilage defects treated by allogenic chondrocyte transplantation［J］.Int Orthop，2006，30（5）：357-361.

［10］虞冀哲，董学海，陈海丹.间充质干细胞应用于软骨组织工程的研究进展［J］.生物骨科材料与临床研究，2015，12（4）：60-64.

［11］Kuroda R，Usas A，Kubo S，et al.Cartilage repair using bone morphogenetic protein 4 and muscle-derived stem cells［J］.Arthritis Rheum，2006，54（2）：433-442.

［12］刘瑾春，刘 霞，曹谊林.体外诱导BMSCs 向软骨分化的方法研究进展［J］.中国修复重建外科杂志，2011，25（5）：618-623.

［13］潘欣宇，崔 颖，马林祥.不同来源骨髓间充质干细胞的体内成软骨［J］.中国组织工程研究与临床康复，2011，15（49）：9128-9132.

［14］Murphy M，Dixon K，Beck S，et al.Reduced chondrogenic and adipogenic activity of mesenchymal stem cells from patients with advanced osteoarthritis［J］.Arthritis Rheum，2002，46（3）：704-713.

［15］Technau A，Froelich K，Hagen R，et al.Adipose tissue-derived stem cells show both immunogenic and immunosuppressive properties after chondrogenic differentiation［J］.Cytotherapy，2011，13（3）：310-317.［16］安荣泽，赵俊延，王兆杰.脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞成软骨能力的比较［J］.中国组织工程研究，2013，17（32）：5793-5798.

［17］Estes B T，Diekman B O，Gimble J M，et al.Isolation of adipose-derived stem cells and their induction to a chondrogenic phenotype［J］.Nat Protoc，2010，5（7）：1294-1311.

［18］Winter A，Breit S，Parsch D，et al.Cartilage-like gene expression in differentiated human stem cell spheroids：a comparison of bone marrow-derived and adipose tissuederived stromal cells［J］.Arthritis Rheum，2003，48（2）：418-429.

［19］Newman K D，Mc Burney M W.Poly（D，L lactic-coglycolic acid）microspheres as biodegradable microcarriers for pluripotent stem cells［J］.Biomaterials，2004，25（26）：5763-5771.

［20］Kramer J，Hegert C，Guan K，et al.Embryonic stem cellderived chondrogenic differentiation in vitro：activation by BMP-2 and BMP-4［J］.Mech Dev，2000，92（2）：193-205.

［21］Zeddou M，Briquet A，Relic B，et al.The umbilical cord matrix is a better source of mesenchymal stem cells（MSC）than the umbilical cord blood［J］.Cell Biol Int，2010，34（7）：693-701.

［22］Montanucci P，Basta G，Pescara T，et al.New simple and rapid method for purification of mesenchymal stem cells from the human umbilical cord Wharton jelly［J］.Tissue Eng Part A，2011，17（21-22）：2651-2661.

［23］Majore I，Moretti P，Stahl F，et al.Growth and differentiation properties of mesenchymal stromal cell populations derived from whole human umbilical cord［J］.Stem Cell Rev，2011，7（1）：17-31.

［24］Deans R J，Moseley A B.Mesenchymal stem cells：biology and potential clinical uses［J］.Exp Hematol，2000，28（8）：875-884.

［25］芮云峰，林禹丞，陈 辉.晚期骨关节炎患者膝关节滑膜间充质干细胞的体外成骨分化［J］.中国组织工程研究，2013，17（45）：7840-7846.

［26］陈 松，符培亮，丛锐军.人滑膜间充质干细胞的分离培养与鉴定［J］.中国骨与关节外科，2014，7（2）：146-151.

［27］袁 洋.滑膜间充质干细胞的生物学特性及其在软骨组织工程中应用的研究进展［J］.海南医学，2015，26（2）：214-217.

［28］陈 松，符培亮，吴海山.滑膜间充质干细胞在软骨修复组织工程中的研究进展［J］.中华关节外科杂志，2013，7（5）：707-710.

［29］Segawa Y，Muneta T，Makino H，et al.Mesenchymal stem cells derived from synovium，meniscus，anterior cruciate ligament，and articular chondrocytes share similar gene expression profiles［J］.J Orthop Res，2009，27（4）：435-441.

［30］Dry H，Jorgenson K，Ando W，et al.Effect of calcium on the proliferation kinetics of synovium-derived mesenchymal stromal cells［J］.Cytotherapy，2013，15（7）：805-819.

［31］Seo S，Na K.Mesenchymal stem cell-based tissue engineering for chondrogenesis［J］.J Biomed Biotechnol，2011，2011（1）：806891-806898.

（2016-03-01 收稿2016-05-26 修回）

（责任编辑潘奕婷）

Research progress on the source of seed cells in cartilage tissue engineering

CONG Bo and ZHANG Zhongwen. The Fourth Department of Orthopedics，General Hospital of Chinese People's Armed Police Forces，Beijing 100039，China Corresponding author：ZHANG Zhongwen，E- mail：zhang6816151@163.com

【Abstract】The morbidity of articular cartilage defects is high.Consequently，life qualities of patients with articular cartilage defects are severely affected；effects of traditional treatment are not good.Tissue engineering techniques has been applied to preliminary clinical practice which showed a promising approach for reparation of cartilage defect.This review focuses on the research development regarding seed cells of cartilage tissue engineering.

【Key words】cartilage；tissue engineering；seed cells

【中国图书分类号】R318

DOI：10.13919/j.issn.2095-6274.2016.06.011

基金项目：“首都临床特色应用研究”项目（Z161100000516013）； 武警总医院一类课题（WZ2012016）

作者简介：丛 波，硕士研究生在读，E-mail：635254548@qq.com

作者单位：100039 北京，武警总医院骨四科

通讯作者：张仲文，E-mail：zhang6816151@163.com