壳寡糖对仿刺参体腔液细胞免疫的影响

卢亚楠，王 武，李 明，张建清，王 丽，丛玉婷

大连海洋大学水产与生命学院，辽宁大连，116023

壳寡糖对仿刺参体腔液细胞免疫的影响

卢亚楠，王 武，李 明，张建清，王 丽，丛玉婷

大连海洋大学水产与生命学院，辽宁大连，116023

考察了三种抗凝剂对仿刺参体腔细胞的抗凝效果，研究了壳寡糖作为免疫添加剂对仿刺参体腔液细胞吞噬能力的影响，利用化学发光法检测壳寡糖对吞噬过程中活性氧作用的影响。结果发现，无菌海水对刺参体腔细胞具有一定的抗凝效果，且细胞形态和活性保持较好，将壳寡糖以1%、3%的质量浓度添加入到基础饲料中，分别检测体腔液细胞吞噬情况和呼吸氧爆发情况，结果表明壳寡糖可显著提高仿刺参体腔液细胞吞噬能力和活性氧水平(P<0.05)，总体表现为1%壳寡糖组>3%壳寡糖组>对照组。

仿刺参；壳寡糖；体腔液细胞；吞噬；活性氧

仿刺参(Apostichopusjaponicus)为我国北方棘皮动物养殖的重要经济种类[1-2]。近年来，随着集约化养殖业的迅猛发展，养殖海参的水体环境逐渐恶化，海参疾病频繁发生，给养殖专业户带来了严重的经济损失[3-4]。为了减少海参疾病造成的损失，养殖专业户大量使用抗生素和化学药物，虽然取得了一定的效果，但污染了水体环境，动物及其产品残留有药物，影响人体健康，因此国家对这类药物的使用已作了严格限制[5]。为了解决海参养殖中病害与食品安全等问题，一些学者着手免疫增强剂的研究，即在海参饲料中添加免疫增强剂如多糖、寡糖、益生菌等，以提高海参机体的免疫机能，进而减少病害的发生。

壳寡糖作为免疫增强剂，在鱼虾和海参的养殖上已有相关研究[6-7]，但对壳寡糖提高海参免疫力的机理和效果鲜有报道。为此，本文研究壳寡糖对仿刺参体腔液细胞吞噬作用和吞噬过程中呼吸氧爆发现象的影响，并探究壳寡糖作为免疫添加剂提高仿刺参体腔液细胞免疫功能的机理和效果，以期为海参的绿色养殖和疾病防治提供可靠的理论依据。

1 材料、仪器与方法

1.1 材料与饲料1.1.1 材 料

仿刺参购于辽宁省普兰店某水产养殖有限公司，大小为25～30 g左右，于(50×35×20)cm PVC水槽内暂养3天，投喂基础饲料(购于大连海洋大学海珍苗种培育基地，为幼参配合饲料)，至仿刺参出现有规律摄食为止。

1.1.2 饲 料

实验用壳寡糖购自大连化学物理研究所。将壳寡糖粉剂分别以0%(对照组)、1%、3%的浓度加到海参基础饲料中，混匀后，置于阴凉、干燥的地方，密封、备用。

1.2 仪器与试剂1.2.1 仪 器

化学发光仪(Centro XS3 LB960型，德国Berthold Technologies公司)，显微镜(Olympus CX21型，日本奥林巴斯有限公司)，高速离心机(GT10-1型，上海化工机械厂有限公司)，真空抽滤器(C-50型，北京众益众和生物技术有限公司)。

1.2.2 试 剂

无菌海水：海水取自大连海洋大学海养楼，用0.45 μm醋酸纤维素膜过滤并高压灭菌。

酵母悬液：取5 mg干酵母，用少量离心仿刺参体腔液自体血清调理2 h以上(室温)，再用无菌海水20 mL配成2 mg/mL的悬液，分装于聚乙烯离心管冰冻贮存，用前融化。

鲁米诺溶液(3-氨基邻苯二甲酰肼)：取0.78 g氢氧化钾、0.618 g硼酸和0.014 g鲁米诺粉剂，溶解于10 mL的双蒸水中，然后移置棕色瓶中，放入冰箱(4℃)贮存[8]。

壳寡糖：用无菌海水配置200 μg/mL寡糖溶液，4℃下贮存备用。

1.3 方 法1.3.1 仿刺参培养

实验分为A、B和C三组，A组为基础饲料组，不加壳寡糖；B组添加1%的壳寡糖；C组添加3%的壳寡糖。每组设2个平行，每个平行随机放入25头25～30 g仿刺参，试验中水温设为(14±2)℃，pH为8±0.12，盐度30。每天投喂饲料一次，定时换水，每次换水约为总水量的三分之一,连续充气。

实验每5天取样一次。使用0.5 mL无菌注射器吸取酵母悬液0.5 mL(用无菌过滤海水配制成4 mg/mL),分别从仿刺参背部注射入体腔，每次每组取2头仿刺参，3 h后解剖、收集体腔液。

1.3.2 体腔液细胞抗凝剂的筛选

选用0.01 mol/L EGTA溶液、1.0 mg/L EDTA-Na2和无菌海水作为体腔液细胞抗凝剂，并分别将它们与体腔液细胞按1∶1的比例混合，显微镜下观察在不同的时间内体腔液细胞形态和细胞群落凝集情况。

1.3.3 吞噬率测定

将所取体腔液与无菌海水按1∶1比例均匀混合，显微镜下观察并记录体腔液细胞吞噬情况。

1.3.4 活性氧测定

从A、B和C三组仿刺参体内各取150 μL体腔液细胞，分别加入发光板孔内，使用Centro XS3LB960化学发光仪测定体腔液的基础发光值，然后加入150 μL鲁米诺溶液，记录发光最高值，考察不同浓度对仿刺参体腔液细胞吞噬过程中呼吸氧爆发的影响。

表1 三种抗凝剂对仿刺参体腔细胞的抗凝效果

注:+++为凝集情况严重.TIF，++为凝集较严重.TIF，+为凝集较轻，-为基本无凝集；P++++为伸展状况好，变形细胞变形明显，无细胞破裂现象；P+++为伸展状况较好，变形细胞伪足伸出明显减少，无明显的细胞破裂现象；P++为伸展情况差，大部分变形细胞缩回伪足，细胞出现轻微破裂现象；P+为变形细胞几乎无伪足伸出，并且细胞出现较严重的破裂现象，体腔液内有细胞破裂物存在。

2 结 果

2.1 体腔液细胞抗凝剂的确定

根据表1，综合细胞形态和细胞群落凝集情况，无菌海水对刺参体腔细胞具有一定的抗凝效果，且细胞形态和活性保持完好，伸展状况好，变形细胞变形明显，无细胞破裂现象，因此选定作为无菌海水仿刺参体腔液细胞抗凝剂。

2.2 饲喂壳寡糖对仿刺参体腔液细胞吞噬率的影响

由图1可知，随投喂时间的延长，不同浓度的壳寡糖对仿刺参体腔液细胞吞噬的影响趋势不同。培养5 d，A组和C组的差异不明显；培养10 d后，B组显著高于A组和C组(P<0.05)。

图1 壳寡糖对仿刺参体腔液细胞吞噬的影响

2.3 饲喂壳寡糖对仿刺参体腔液细胞吞噬过程中呼吸氧爆发的影响

由图2可知，各组仿刺参体腔液细胞吞噬过程中呼吸氧爆发均随时间延长呈现出不同的趋势。10天后，B组呼吸氧爆发活性变化明显，且均显著高于A组和C组(P<0.05)。

图2 壳寡糖对仿刺参体腔液细胞吞噬过程中呼吸氧爆发的影响

4 结 论

从以上实验结果可知，壳寡糖对仿刺参非特异性免疫能力产生了影响，且浓度不同作用效果不同，一般随着壳寡糖浓度的升高，作用有一个由低到高，再由高到低的变化，但高浓度未见有抑制作用。具体来说，投喂壳寡糖对仿刺参吞噬情况和呼吸氧活性有显著增强效应，虽在不同个体体腔液中作用时间和作用效果有些差异，但均能表现出免疫指标的增强，对仿刺参体腔液中吞噬情况和呼吸氧活性的影响几乎都在15天左右达到最高，且壳寡糖添加质量百分比为1%比较合适。

[1]Yang H,Yuan X,Zhou Y．et a1．Effects of body size and water temperature on food consumption and growth in the sea cucumber Apostichopus japonicas (Selenka) with special reference to aestivation[J].Aquac Res,2005,36:1085-1092

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[8]Scott L k,Klesius P H.Chemiluminescence:A novel analysis of phagocytosis in fish[J].Dev Biol Stand,1981,49:243-254

(责任编辑：汪材印)

10.3969/j.issn.1673-2006.2016.12.025

2016-08-12

辽宁省教育厅一般计划项目(L2013278)。

卢亚楠(1977-),女,辽宁营口人,博士,实验师,主要研究方向:水产动物医学。

R734.2

A

1673-2006(2016)12-0086-03