抑制HPV18型E7蛋白的表达对Hela 细胞生物学特性及miR-204表达的影响

范 幸，周燕飞，祖月娥

(长沙市妇幼保健医院妇科门诊，湖南 长沙 410007 )

抑制HPV18型E7蛋白的表达对Hela 细胞生物学特性及miR-204表达的影响

范 幸，周燕飞，祖月娥

(长沙市妇幼保健医院妇科门诊，湖南 长沙 410007 )

目的 通过小干扰RNA(siRNA)抑制宫颈癌Hela细胞中人乳头瘤病毒(HPV)18型E7的表达，研究E7蛋白对Hela细胞的生物学特性和miR-204表达的影响和关系，探索HPV致癌的分子机制。方法设计合成靶向HPV18型E7基因的siRNA，转染Hela细胞，抑制HPV18-E7的表达；采用RT-PCR和Western blot分别检测Hela细胞中HPV18-E7的mRNA和蛋白水平，用流式细胞术检测Hela细胞的细胞周期和凋亡，通过荧光实时定量PCR检测miR-204的表达水平。结果pRNAT-HPVE7与两个对照组比较，明显抑制了Hela细胞HPV18-E7的mRNA(t值分别为2.69、2.46，均P<0.05)和蛋白(t值分别为3.93、4.20，均P<0.05)的表达，细胞周期趋于正常，凋亡率增高(t值分别为-6.87、-6.92，均P<0.05)，miR-204表达水平也明显升高(t值分别为0.26、0.22，均P<0.05)。结论抑制HPV18-E7基因的表达能改变Hela细胞的生物学特性和上调miR-204表达。

小干扰RNA；HPV E7蛋白；miR-204；细胞周期；细胞凋亡

全球每年有50多万例新发的宫颈癌，而我国每年新发宫颈癌也超过13万例，其中约8万例死于宫颈癌，居国内女性恶性肿瘤发病率和死亡率的第2位，且宫颈癌的发病呈逐年上升趋势。研究发现在约90%宫颈癌组织中可检测到人类乳头瘤病毒，其中HPV16/18等高危型HPV感染与宫颈癌密切相关[1]。而人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)的E6、E7蛋白表达是维持肿瘤细胞处于转化活性状态所必须的[2]。miRNA是新近发现的内源性非蛋白编码的单链小分子RNAs，长度18～24nt，广泛存在于动物等多细胞真核生物中。主要通过与靶基因mRNA的3'-非翻译区(3'-UTR)的序列互补而在转录后水平调控靶基因表达。多项研究显示，miRNA表达的改变与人类肿瘤发生、发展和病毒感染密切相关[3]。研究HPV致病蛋白与miRNA的关系是探索宫颈癌的发生发展的分子机制的新途径，为宫颈癌的基因治疗提供了新的可能性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究于2014年9月至2015年8月在中南大学肝病研究所完成，相关实验材料包括：胎牛血清购自Gibico公司，DMEM(高糖)细胞培养基购自HyClone公司，胰酶购自Amresco公司，转染阳离子脂质体lipofectemin 2000购于美国Invitrogen公司，G418和MTT试剂购自Promega公司，逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)试剂盒购自Fermentas公司。鼠抗HPV18 E7单克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体和HRP标记的羊抗鼠IgG均购自Santa Cruz公司，HeLa细胞株为本实验室保存。

1.2 实验方法

1.2.1 小干扰RNA的设计与合成

根据Genebank上公布的HPV18-E7编码基因的序列(Y18491.1)，按照小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)筛选原则获得多个靶点序列，通过同源性验证确定与人类基因并无同源，最后筛选获得一个靶点序列为：CGAGCAATTAAGCGACTCA，再根据靶点序列设计成E7-siRNA：CGAGCAAUUAAGCGACUCA，按照以上步骤设计一条随机序列的阴性对照NC-siRNA：AGUAGUAACGAUGC￣CACCA，并由上海生工生物工程有限公司合成，并用绿色的异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)作标记，以示踪siRNA的转染效率。

1.2.2 Hela细胞的培养和转染

将宫颈癌Hela细胞株从液氮中取出、复苏，使用完全培养基(含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基)重悬，置37℃、5%CO2 的培养箱内培养，细胞贴壁生长至80%～90%融合状态时用0.25%胰酶消化进行传代培养。将培养的Hela细胞分三组接种到60mm培养皿中，按照说明书，使用阳离子脂质体lipofectemin 2000将对照NC-siRNA和靶标E7-siRNA分别转染其中两组细胞，另一个组细胞作为空白对照不作任何处理。细胞转染24h后更换新鲜培养基，继续培养至72h，收集细胞。

1.2.3 人乳头瘤病毒18-E7的mRNA和蛋白表达水平检测

收集细胞，用Trizol试剂吹打溶解细胞，严格按照说明书步骤，提取细胞总RNA。各取2μgRNA进行逆转录，按照RT-PCR试剂盒操作步骤合成cDNA，以cDNA为模板，以GAPDH作为内参照，运用PCR扩增目的基因HPV-E7，HPV-E7的上游引物为：5'- ATGCATGGACCTAAGGCA -3'， HPV-E7的下游引物为：5'- TTACTGCTGGGATGCACA -3'，扩增片段的长度为318bp；GAPDH的上游引物为：5'- CAAGGTCATCCATGA￣CAACTTTG -3'，GAPDH的下游引物为：5'- GTCCACCACC￣CTGTTGCTGTAG -3'，扩增片段长度为496bp。PCR条件为：94℃预变性3min，进入循环：94℃变性30sec、60℃退火30sec、72℃延伸30sec,共30个循环，然后72℃延伸7min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析。实验重复3次，电泳图片应用Scion Image软件分析灰度值，并计算相对定量值,公式为：相对定量值=目的基因灰度值/内参基因灰度值。

收集3组Hela细胞，加入细胞裂解液(50mmoL/LTris pH 8.0，150mmol/L NaCl，1%PMSF，0.1% Aprotinin，1% Trinton X-100)，混匀后置冰上15 min，13 000rpm，离心5min，收集上清液为胞浆蛋白，BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。分别取等量蛋白40ug，12%SDS-PAGE电泳，湿式电转移法把蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上，再用3%脱脂牛奶室温封闭2h。加鼠抗HPV18 E7单克隆抗体为一抗(1：1 000)，以鼠抗人β-actin单克隆抗体为内参抗体(1：2 000)。4℃孵育过夜，PBST洗膜3次。加入HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗(1：2 000)，37℃孵育2 h, PBST洗膜3次。于暗室滴加ECL化学发光液，然后压片、显影、定影。实验重复3次，应用Scion Image软件分析灰度值，并计算相对定量值,公式为：相对定量值=目的基因灰度值/内参基因灰度值。

1.2.4 流式细胞术检测3组细胞的周期变化和凋亡水平

分别转染了对照NC-shRNA和靶标E7-shRNA的细胞和空白对照细胞，培养72h后使用0.25%的胰酶将细胞消化下来，各加入完全培养基终止消化，吹打混匀，2 000rpm离心5min，然后用PBS洗涤细胞一次，2 000rpm离心5min收集细胞沉淀，最后用70%乙醇重悬固定细胞。细胞送北京鼎国生物公司进行细胞流式检测细胞周期和凋亡。

1.2.5 Real-Time检测miR-204在3组细胞中的水平

按照Trizol一步法提取细胞中总RNA，并通过分光光度计定量。各取2μgRNA，加入miR-204及U6逆转录引物进行逆转录，引物序列分别是miR204-RT：5'-GTCGTATCCAGTG￣CAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGGCAT-3'，U6-RT：5'- TTCACGAATTTGCGTGTCAT -3'。转录完成后，取cDNA适量加入miR-204或U6扩增引物，对miR-204和U6进行real-time PCR扩增，引物序列分别是：U6-F：5'- CGCTT￣CGGCAGCACATATAC-3'；U6-R：5'- TTCACGAATTTG￣CGTGT￣CAT -3'；Mir204 -F：5'-TCGCCTTCCCTTTGTCATCCT-3'；Mir204-R：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。PCR仪自动读取荧光数据绘制扩增曲线，最终获得扩增CT值，按照相对定量的数学模型，根据公式：RQ=2-△△CT，计算出miR-204在3组细胞中的相对表达量，并进行比较和统计学分析。

2 结果

2.1 Hela细胞的培养和转染

由于合成的siRNA都标记了绿色荧光素FITC，在siRNA转染后24h即可在荧光显微镜下观察到细胞内的绿色荧光素FITC，而空白对照细胞则无法观察到绿色荧光，证明NC-siRNA和E7-siRNA均已经成功转染到Hela细胞中(图1)。

2.2 RT-PCR和Western Blot分别检测HPV18-E7的mRNA和蛋白表达水平

RT-PCR结果显示，HPV18-E7的mRNA在空白对照组细胞(Blank)和随机对照siRNA转染细胞(NC-siRNA)中均高表达，而E7-siRNA转染细胞中HPV18-E7的mRNA表达水平很低，说明E7-siRNA对HPV18-E7的mRNA起到了RNA干扰作用(图2、图3)。Wester Blot结果显示，在空白对照组细胞(Blank)和随机对照siRNA转染细胞(NC-siRNA)中，HPV18-E7蛋白质的表达水平均很高。而E7-siRNA转染细胞中HPV18-E7的蛋白质表达水平很低，说明E7-siRNA对HPV18-E7的蛋白表达水平也起到了很大的抑制作用(图4、图5)。

注：Blank为空白对照细胞；NC-siRNA为随机对照siRNA转染细胞；E7-siRNA为HPV-E7的siRNA转染细胞。

注：1.空白对照细胞；2.随机对照siRNA转染细胞；3.HPV18-E7的siRNA转染细胞。

注：* 表示与两个对照组比较，有统计学差异(t值分别为2.69和2.46，均P<0.05)

2.3 流式细胞术检测3组细胞的周期变化和凋亡水平

由流式细胞结果可知，两个对照组之间没有显著性差异，而与两个对照组相比，E7-siRNA组细胞的G1期阻滞，G2期和S期比率相应降低，凋亡率却明显升高(见表1、图6)。

2.4 Real-Time PCR检测miR-204在3组细胞中的水平

实验结果显示，对照组之间比较，miR-204的表达水平并无统计学差异，而E7-siRNA组与两个对照组比较，miR-204表达显著升高，这表明HPV18-E7被抑制后上调了miR-204的表达(见图7)。

注：1.空白对照细胞；2.随机对照siRNA转染细胞；3.HPV18-E7的siRNA转染细胞。

注：*表示与两个对照组比较，有统计学差异(t值分别为3.93和4.20，均P<0.05)

Blank NC-siRNA E7-siRNA

表1 流式细胞术检测3组细胞的细胞周期和凋亡率

注：(Blank：空白对照细胞，NC-siRNA：随机对照siRNA转染细胞；E7-siRNA：HPV-E7的siRNA转染细胞。*表示与两个对照组比较，有统计学差异(t=0.26和0.22，P<0.05)

图7 Real-time PCR检测miR-204在3组细胞中的水平

Fig.7 The levels of miR-204 in cells among three groups detected by Real-time PCR

3 讨论

3.1 靶向siRNA对Hela细胞HPV18-E7的mRNA和蛋白水平的影响

Hela细胞是取自一位美国妇女的子宫颈癌组织，它是被人乳头状病毒第18型(HPV18)感染并转化的永生化细胞系。1984年，德国病毒学家楚尔豪森利用Hela细胞证明了人乳头状病毒(HPV)会导致宫颈癌发生。通过本实验发现该细胞易于培养、转染效率高，非常适合对HPV蛋白的功能研究。

本数据表明，E7-siRNA可在mRNA和蛋白质水平上明显下调HPV18-E7的表达。研究发现，高危型HPV的E6、E7能够增加外源DNA 插入宿主基因组的频率，导致在大多数浸润性宫颈癌均有高危型 HPV 的DNA 插入宿主的基因组；而且高危型HPV的E6和E7整合于宫颈癌宿主细胞基因组后可持续稳定表达E6和E7蛋白，并干扰已发生DNA损伤细胞的依赖于p53的G1期阻滞、DNA修复的过程，从而使宿主DNA不稳定，损伤得以累积，易于致癌[4-5]。HPV18-E7在Hela细胞内高表达，通过下调E7的表达，能观察到细胞生物学特性和某些关键分子的变化，可以初步确定E7在致癌方面的分子机制。

3.2 siRNA靶向HPV18-E7对Hela细胞周期和凋亡的影响

当HPV18-E7蛋白的表达下调后，通过流式细胞术观察到Hela细胞的G1期阻滞，凋亡率明显升高。这可能是因为HPV18-E7被siRNA靶向抑制后可上调P53、pRb、P16等细胞周期及凋亡相关蛋白的表达，从而抑制Hela细胞的生长和增殖，并促进了Hela细胞的凋亡[6]。同时也说明HPV18-E7在改变细胞周期和细胞抗凋亡方面的重要作用。

3.3 si RNA靶向HPV18-E7对Hela细胞miR-204水平的影响

miR-204定位于人类9号染色体上73424891～73425000位置之间。成熟的单链miRNA分子序列为5'UUCCCU￣UUGUCAUCCU￣AUGCCU3'，miR-204的成熟序列在人、小鼠、大鼠、大象和金鱼等脊椎动物中表现为高度保守。近年研究表明miR-204可能成为一种新的抑癌基因，它通过抑制靶mRNA翻译或诱导靶mRNA降解在转录后水平调控基因表达，具有抑癌基因的功能[7-9]。据报道，miRNA-204等在子宫内膜腺癌中与邻近的非肿瘤性的内膜组织相比，显著低表达，这对于研究miR-204在HPV感染导致的宫颈癌中的作用起到了指导作用[10]。

通过RNA干扰技术下调Hela细胞内源性病毒蛋白HPV18-E7的表达，还观察到具有抑癌作用的miR-204水平随着HPV18-E7蛋白表达的抑制而升高。我们经过软件预测发现与宫颈癌关系密切的癌基因Ezrin[11]的3'非编码序列上有miR-204结合的靶点。因此推断，HPV18-E7可能通过抑制miR-204的表达，来上调Ezrin的表达，这有可能是HPV致宫颈癌的一条分子途径，其分子机制有待我们进一步验证和探索，可能为宫颈癌的基因治疗提供新的靶标。

[1]de Sanjose S, Quint W G, Alemany L,etal.Human papillomavirus genotype attribution in invasive cervical cancer: a retrospective cross-sectional worldwide study[J]. Lancet Oncol,2010,11(11):1048-1056.

[2]任睿,刘会玲,祝秉东,等.高危型HPV E6、E7蛋白致宫颈癌的分子机制研究[J].甘肃中医学院学报,2010,27(4):70-74.

[3]Hu X, Schwarz J K, Lewis J S Jr,etal.A microRNA expression signature for cervical cancer prognosis[J].Cancer Res,2010,70 (4):1441-1448.

[4]孙志辉,岳天孚.人乳头瘤病毒16/18型与宫颈癌[J].国际妇产科学杂志,2010,37(2):119-121,138.

[5]Liu S S,Tsang P C,Chan K Y,etal.Distribution of six oncogenic types of human papillomavirus and type 16 integration analysis in Chinese women with cervical precancerous lesions and carcinomas[J]. Tumour Biol, 2008, 29(2):105-113.

[6]Qi Z, Xu X, Zhang B,etal. Effect of simultaneous silencing of HPV-18 E6 and E7 on inducing apoptosis in HeLa cells[J]. Biochem Cell Biol,2010,88(4):697-704.

[7]Lee Y, Yang X, Huang Y,etal. Network modeling identifies molecular functions targeted by miR-204 to suppress head and neck tumor metastasis[J]. PloS Comput Biol,2010, 6(4):e1000730.

[8]Chung T K,Lau T S,Cheung T H,etal.Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1[J]. Int J Cancer, 2012, 130(5):1036-1045.

[9]Chen L,Yan H X,Yang W,etal.The role of microRNA expression pattern in human intrahepatic cholangiocarcinoma[J]. J Hepatol, 2009, 50(2):358-369.

[10]Wu W, Lin Z, Zhuang Z,etal. Expression profile of mammalian microRNAs in endometrioid adenocarcinoma[J]. Eur J Cancer Prev, 2009, 18(1):50-55.

[11]Tan J, Zhang C, Qian J.Expression and significance of Six1 and Ezrin in cervical cancer tissue[J].Tumour Biol,2011,32(6):1241-1247.

[专业责任编辑：张忠明]

Effects of inhibiting expression of human papillomavirus type18 E7 protein on biological properties of Hela cells and expression of miR-204

FAN Xing, ZHOU Yan-fei, ZU Yue-e

(OutpatientDepartmentofGynecology,ChangshaHospitalforMaternalandChildHealthCare,HunanChangsha410007,China)

Objective To study on the effects of E7 protein on biological properties of Hela cells and expression of miR-204 through inhibiting the expression of human papillomavirus type 18 E7 (HPV18-E7) protein in cervical cancer Hela cells with small interfering RNA (siRNA) so as to explore the molecular mechanism of HPV carcinogenesis. Methods SiRNA targeting HPV18-E7 was designed and synthesized, and siRNA was transfected into Hela cells to inhibit the expression of HPV18-E7. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot were used to assess the level of mRNA and protein of HPV18-E7 in Hela cells. In addition, flow cytometry was used to detect cell cycle and apoptosis of Hela cells. Florescent real-time quantitative PCR was used to measure the level of miR-204 expression. Results Compared with two control groups, results showed that pRNAT-HPVE7 could significantly inhibit the expression of mRNA (tvalue was 2.69 and 2.46, respectively, bothP<0.05) and protein (tvalue was 3.93 and 4.20, respectively, bothP<0.05) of HPV18-E7 in Hela cells. Besides, cell cycle showed a tendency to be normal while an increase was witnessed in apoptosis rate (tvalue was -6.87 and -6.92, respectively, bothP<0.05). In addition, a significant increase in miR-204 expression was also seen (tvalue was 0.26 and 0.22, respectively, bothP<0.05).Conclusion Inhibited expression of HPV18-E7 genes can lead to changes in the biological properties of Hela cells and up-regulation of miR-204 expression.

small interfering RNA (siRNA); HPV18-E7 protein; miR-204; cell cycle; apoptosis

2015-09-07

范 幸(1977-)，女，副主任医师，在读硕士研究生，主要从事妇科肿瘤的研究。

祖月娥，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.06.008

R737.3

A

1673-5293(2016)06-0694-04