一株猪源产气荚膜梭菌分离、鉴定及药敏试验

2016-02-03蒋增海徐耀辉王扬伟卢建州河南牧业经济学院动物医学系河南郑州450046河南省猪病防控工程技术研究中心河南郑州450046

中国兽医杂志 2016年5期

蒋增海，徐耀辉，王扬伟，卢建州（1.河南牧业经济学院动物医学系，河南郑州450046；2.河南省猪病防控工程技术研究中心，河南郑州450046）

蒋增海1，2，徐耀辉1，2，王扬伟1，2，卢建州1，2
（1.河南牧业经济学院动物医学系，河南郑州450046；2.河南省猪病防控工程技术研究中心，河南郑州450046）

产气荚膜梭菌，根据产毒素能力分为A、B、C、D和E 5个血清型。一般认为C型菌株是导致2周龄内仔猪肠毒血症和坏死性肠炎的主要病原，而A型菌株则与哺乳及育肥猪肠道疾病有关[1]。因此，猪产气荚膜梭菌病主要由A型、C型产气荚膜梭菌引起各种年龄阶段的猪发生一种急性、致死性肠道传染病。产气荚膜梭菌除了引起1周龄仔猪发生的高度致死性、坏死性肠炎外，近年来，由产气荚膜梭菌引起育肥猪、后备种猪、怀孕母猪等猝死常有报道[2-4]。2014 年12月中旬，河南某规模化肥育猪场，从外地购买仔猪，饲养到体重25～40 kg阶段，在较长一段时间内，零星发病，表现为突然死亡，死后腹部膨大、臌气，外观整个身躯像一个圆形皮球，剖检肠臌气、膨大，外观呈鲜红色（见中插彩版图1）。笔者根据流行特点、临床症状和病理变化，初步诊断为猪产气荚膜梭菌病，同时采集肠道内容物和肠系膜淋巴结等病料，进行了病原分离、鉴定以及药敏试验，报告如下。

1　材料与方法

1.1培养基5%绵羊鲜血琼脂平板，购自郑州博赛生物技术服务有限公司；营养琼脂粉、营养肉汤粉，购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2药敏纸片强力霉素、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、氧氟沙星、头孢拉定、卡那霉素、新霉素、克林霉素、阿奇霉素、青霉素和磺胺类药物等，均购自北京天坛药物生物技术开发公司。

1.3生化试验试剂各种生化试管，购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.4健康小鼠由本校实验动物中心提供。

1.5方法

1.5.1涂片镜检无菌采集肠系膜淋巴结、肠道内容物，均匀涂抹于洁净载玻片上，自然干燥，火焰固定后，分别进行瑞氏染色和革兰染色。

1.5.2细菌分离、培养无菌采集肠系膜淋巴结、肠道内容物，接种绵羊鲜血琼脂平板，37℃、厌氧（密闭罐内，蜡烛火焰燃法）培养12～24 h，根据细菌生长情况，再挑取溶血性菌落，进一步纯化、传代，接种营养琼脂平板厌氧培养。

1.5.3生化试验将所分离纯培养物接种牛乳培养基和生化试验管，37℃、厌氧培养，观察其生化反应特性。

1.5.4药敏试验挑取血琼脂平板纯化培养物，接种于灭菌营养肉汤，37℃、厌氧培养24 h后取出，生理盐水稀释0.5麦氏浑浊度，然后灭菌棉签蘸取菌液，均匀涂抹于无菌普通营养琼脂平板，贴上药敏纸片，次日测定抑菌圈。

1.5.5致病性试验挑取分离纯化培养物，接种于营养肉汤培养基，37℃、厌氧培养16 h，作为攻毒所用的菌液，同时平板培养计数。选取8只健康小鼠，随机分为2组，每组4只，1组为试验组，另外1组为对照组。试验组，每只小鼠腹腔接种上述培养菌液0.1 mL；对照组，每只小鼠腹腔接种灭菌营养肉汤培养基0.1 mL。接种后，观察1周。

2　结果

2.1细菌形态和培养特征病料、培养物染色镜检后，均可以观察到革兰阳性、两端略微纤细、带有荚膜的大杆菌，有的还可以观察到芽孢，有的菌体略微弯曲，如图2所示。接种病料后，37℃、厌氧培养，均可在血琼脂平板、营养琼脂平板生长，菌落呈“勋章样”、“边缘锯齿状”，血琼脂平板溶血，如图3，4所示。

2.2生化试验葡萄糖、蔗糖、麦芽糖阳性；甘露醇、乳糖阴性；牛奶石蕊培养结果为酸化和凝固；明胶液化试验为阳性。符合产气荚膜梭菌的生化特征。

2.3药敏试验药物抑菌圈结果如下，头孢拉定：25 mm，多西环素：25 mm，氧氟沙星：23 mm，环丙沙星：23 mm，阿米卡星：23 mm，庆大霉素：22 mm，克林霉素：21 mm，阿奇霉素：19 mm，新霉素：19 mm，卡那霉素：20 mm，青霉素：0 mm，磺胺甲噁唑：0 mm。试验结果表明，头孢拉定、多西环素抑菌效果最好，而青霉素和磺胺甲噁唑完全耐药。

2.4致病性试验通过平板计数结果表明，试验组每只小鼠接种细菌数为1.61×1011CPU。观察1周后，对照组小鼠没有任何临床症状，全部健在，无死亡；试验组小鼠，接种后24 h死亡1只，26 h死亡1只，两只小鼠健在，死亡的两只小鼠均为个体较大者，死亡后腹部膨大，腹腔积液。动物致病性试验结果表明，分离的产气荚膜梭菌对小鼠具有一定的致病性。