环导等温扩增（LAMP）技术在奶牛常见疾病诊断中的应用

杨　柳，陈宇飞（吉林工商学院食品工程学院，吉林长春130507）



环导等温扩增（LAMP）技术在奶牛常见疾病诊断中的应用

杨柳，陈宇飞
（吉林工商学院食品工程学院，吉林长春130507）

奶牛养殖业作为新兴产业和朝阳产业，得到了快速发展，与此同时，奶牛各类疾病发病率尤其是普通病的发病率居高不下，严重影响着我国奶牛业的健康发展和乳品安全。徐孝宙等[1]对奶牛的疾病进行调查研究，发现乳房炎、子宫内膜炎、腐蹄病发病率高，为奶牛3大常见疾病。王君伟等[2]研究发现，在各种奶牛传染病中，布病（布鲁菌病）与结核病危害最为严重。

目前，奶牛疾病诊断常用的方法有细菌分离及生化鉴定法、免疫胶体金法等传统检测方法和PCR分子生物学检测法[3-5]。传统的细菌分离及生化鉴定法培养要求高，诊断难度大，所需时间长；RCR检测方法虽然敏感度较高，但是需要依赖昂贵复杂的精密仪器，难以在条件较差的基层推广普及应用[6]。因此，建立一种快速、简便、准确的奶牛疾病诊断技术十分重要。

本文针对环介导等温扩增技术在奶牛5种常见疾病诊断中的应用情况进行综述，分析环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术在奶牛常见疾病诊断中应用的优势，旨在为LAMP技术在奶牛疾病诊断中更深入的应用提供一定的参考。

1　环介导等温扩增技术简介

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal am⁃plification，LAMP）是Notomi等在2000年建立的一种新的体外扩增特异DNA片段的分子生物学技术[7]。

LAMP技术是在65℃恒温条件下进行核酸快速扩增，利用两条特异性内引物和两条特异性外引物识别靶基因上的六个区域，其DNA聚合酶具有链置换活性，几十分钟即可完成核酸扩增[8]。

2　LAMP技术在奶牛常见疾病诊断中的应用

2.1乳房炎诊断奶牛乳房炎是世界奶牛养殖业中发病率最高、流行最快，造成损失最大的疾病之一，在奶牛泌乳期发病率高达78%以上[9]。该病是由奶牛乳腺组织受到物理、化学、微生物刺激所发生的一种炎性反应。主要影响奶牛泌乳机能，可导致产奶量减少，乳品质下降。乳房炎的预防与治疗难度很大，原因主要在于其致病菌的多样性和易感牛、病原、环境之间的相互作用。

贺婷等[10]应用环介导等温扩增技术，建立了链球菌性乳房炎LAMP可视化检测方法，对链球菌检测的敏感性最高达到52 fg/μf，是普通PCR方法的10倍。

彭清洁等[11]以FIP、BIP为内引物，以F3、B3为外引物对牛支原体DNA进行恒温扩增，建立了牛支原体引起奶牛乳房炎的环介导等温扩增方法，给牛支原体病的临床诊断带来了极大的方便。

2.2子宫内膜炎诊断奶牛子宫内膜炎是最常见的一种奶牛生殖器官疾病，是造成奶牛不孕不育的主要因素之一，是降低奶牛饲养户利益的重要原因，是制约奶牛事业发展的大敌。

奶牛子宫内膜炎现检出的主要病原菌包括化脓性链球菌、大肠杆菌、葡萄球菌、变形杆菌、乳链球菌、绿脓杆菌、化脓性棒状杆菌等。

唐婕等[12]建立了能引起多种动物，如猪、牛、羊、禽和人类感染，出现乳房炎、子宫内膜炎的化脓隐秘杆菌，曾被称为化脓棒状杆菌、化脓放线菌的LAMP检测方法。

2.3腐蹄病诊断奶牛腐蹄病是一种急性高度接触性传染病，发生在反刍动物趾间，患有腐蹄病的奶牛通常表现为精神萎靡、食欲减退、产奶量下降，严重者将会面临淘汰。奶牛腐蹄病占奶牛疾病的40%以上，患腐蹄病奶牛的淘汰率占总淘汰率的19%，因此加强该病的预防尤为重要[13]。

多数学者认为，奶牛腐蹄病的主要病原体是坏死杆菌和节瘤拟杆菌，该病的发生主要是由坏死杆菌和节瘤拟杆菌共同感染而引起的[14]。

Sun[15-17]等利用白细胞毒素基因作为扩增靶基因，建立了检测奶牛腐蹄病坏死杆菌的环介导等温扩增方法（Fn-LAMP）和节瘤拟杆菌环介导等温扩增方法（Dn-LAMP）。

两种方法不需特殊的仪器和昂贵的检测试剂，在电子恒温水浴锅内1 h即可完成奶牛腐蹄病坏死杆菌和节瘤拟杆菌的检测，结果肉眼可见。Fn-LAMP和Dn-LAMP检测能力为1 CFU/ mL，与PCR法相比，符合率为92.0%。研究结果显示，Fn-LAMP和Dn-LAMP给合可用于奶牛腐蹄病的流行病学调查。

2.4布鲁菌病诊断布鲁菌病是重要人兽共患慢性传染病[17]，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须通报的传染病之一，我国将其列为二类动物疫病[2]。

许邹亮等[18]建立了布鲁菌环介导等温扩增可视化检测方法，该方法最低检出限为17 fg，与B4/ B5PCR方法进行比较，这两种方法的结果符合率为85.0%，且LAMP方法的敏感性高于B4/B5PCR。

蔺国珍[19]建立了布鲁菌快速检测LAMP方法，从奶样和血样中检出6个种的布鲁菌病原，所能检测出的最低限度为9 fg/μL，较PCR方法高出10倍。

2.5结核病诊断奶牛结核病是由分支杆菌属牛分枝杆菌引起的一种慢性消耗性传染病，由于该病也感染人，所以是人兽共患病。

陈伟[20]针对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌共有的基因序列RV3877设计特异性引物，能检测出结核分枝杆菌与牛分枝杆菌，并且有很高的特异性，灵敏度达到16个菌/模板。

3　LAMP技术应用于在奶牛常见疾病诊断中的优势

3.1诊断特异性强在奶牛常见疾病诊断方面，与传统诊断方法以及PCR检测方法相比，LAMP技术具有了更强的特异性。主要原因是：LAMP技术是利用2对引物（内引物与外引物），与靶序列上的6个特异性部位进行准确结合发生扩增反应，如果6个区域中的任何区域与引物不匹配，则都不能进行核酸扩增。

3.2诊断灵敏度高贺婷[6]对奶牛链球菌性乳房炎可视化LAMP检测方法进行研究，得出LAMP对无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌DNA检出限依次为52.6 fg/μf，48.9 fg/μf，3.55 fg/μf，敏感性为100%。唐婕等[12]对化脓性棒状杆菌LAMP检测方法的研究，灵敏度在DNA水平上可达112 fg。综合各文献数据，可得出结论：与PCR诊断方法相比，LAMP检测灵敏度通常是常规PCR的10～100倍。

3.3诊断速度快许邹亮等[18]对布鲁菌环介导等温扩增方法的研究，LAMP反应在60 min完成。

综合各文献数据，可得出结论：LAMP技术用于奶牛疾病诊断的基本反应可以在60～90 min内完成，如果加入环引物，则能使反应时间缩短为30～45 min。

3.4诊断更便捷在LAMP检测体系中可加入钙黄绿素荧光染料，这样试验的结果即可产生绿色荧光，使得目视检测效果好。利用LAMP技术开发配套诊断试剂盒，只需对检测原料进行简单的DNA提取，就可以完成直接的扩增和诊断。与PCR方法相比，LAMP诊断方法不需要购买昂贵的仪器设备，只需配一台普通的水浴锅，就可以完成现场检测，特别适用于基层、农村、偏远山区进行奶牛常见疾病的诊断。

4　结语

LAMP检测技术非常适用于进行奶牛常见疾病的实时定性检测。相信随着LAMP检测技术的不断完善，在不久的将来，它将逐渐取代传统的诊断方法以及PCR检测方法，推动奶牛常见疾病诊断技术朝着更准确、更廉价、更便捷的方向发展。

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[20]陈伟.结核分枝杆菌复合群多重PCR和LAMP检测方法的建立及临床应用[D].武汉：华中农业大学.2010.

中图分类号：S823.8

文献标志码：A

文章编号：0529-6005（2016）05-0064-02

收稿日期：2015-09-10

作者简介：杨柳（1975-），女，副教授，本科，主要从事畜产品加工及安全检测研究，E-mail：yl0313@163.com

通讯作者：陈宇飞，E-mail：254447088@163.com