牛贝诺孢子虫病研究进展

毕　磊，张煜涵，刘　畅，黄大鹏，路义鑫

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

牛贝诺孢子虫病研究进展

毕磊，张煜涵，刘畅，黄大鹏，路义鑫

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

牛贝诺孢子虫病又称牛球孢子虫病，是由贝氏贝诺孢子虫（Besnoitia besnoiti）引起的一种急性、亚急性和慢性感染的牛原虫性寄生虫病。

贝诺孢子虫最早是由Cadeac（1884）在法国南部牛群中发现的，近些年，欧洲的法国和西班牙地区都有大规模的牛贝诺孢子虫病暴发。德国、意大利和东欧中部地区均报道了此病的流行［1］，给世界各地的养牛业带来巨大经济损失。欧洲食品安全组织（EFSA）已经认定贝诺孢子虫病为重现疾病，并且在欧洲地方性流行［2］。国内最早是由刘尔翔于1957年在北京某屠宰场发病黄牛病变皮肤中发现并鉴定为贝诺孢子虫。

近年来，随着牛贝诺孢子虫病的广泛流行，国内外对于本病进行了更深入的研究，其进展综述如下。

1　病原体

1.1种属及其生物特性贝诺孢子虫属顶复门、孢子虫纲、真球虫目、肉孢子虫科、住肉孢子虫亚科、贝诺孢子虫属。目前的数据显示，贝诺孢子虫属的贝诺孢子虫还未发现对人有感染性。现今至少有10种贝诺孢子虫在世界范围内被确定，大多数报道来自有袋动物和微型哺乳动物，包囊分布于体内，位置多在肠系膜，并且猫已被确认为多个种的终末宿主。相反，对皮肤高度趋化的有寄生于马属动物的B.bennetti，寄生于鹿科的B.tarandii和寄生于牛的B.besnoiti。B.oryctofelisi、B.neotomofelis和B.darling已在美洲大陆的啮齿动物和兔类体内发现确认，并表现明显特征，已经确定它们的终末宿主为猫［3］。B. tarandii和B.bennetti仅出现在欧洲和美洲各地，B. besnoiti流行于南非、以色列，以及欧洲和亚洲不同国家，寄生于山羊的B.caprae发生于伊朗和肯尼亚。到目前为止，这4个种各自的传播方式和终末宿主还未确定，因此无法确认它们的有性生殖是否发生，如何发生。有人怀疑贝诺孢子虫和弓形虫相似，在中间宿主体内仅有无性生殖，于终末宿主内出现有性生殖，但难以确认。研究者试图用贝氏贝诺孢子虫包囊感染猫，仅有一个报道用疑似感染贝氏贝诺孢子虫的牛组织喂给猫后成功感染猫。但是有人在1976年、1989年分别进行过同样的实验均未能得到满意的实验结果。并且有人用组织包囊喂给猫同样未能成功感染。现已确认的贝诺孢子虫还有寄生于啮齿动物的B.jellisoni、寄生于仓鼠的B.wallacei和在巴西发现的寄生于鼠的B.akodoni。

现今对贝诺孢子虫属所有的系统分析都基于对ITS1基因序列的利用。虽然未能破解全序列信息，但已经可以利用ITS1证明贝诺孢子虫的种属特异性。对ITS1的研究结果已经被用于种的区分。并且ITS1转录区间在很多种类表现出高度保守性，各种间的ITS1转录区可能与各自的地域起源关系不大，而是与各自中间宿主的性质相关。

据Nobel报道，贝氏贝诺孢子虫对牛的生殖器官有一定的趋向性，这可能是引起公牛不育、母牛不孕的原因。有人尝试接种兔，发现贝诺孢子虫对兔有高度致死性，但经多次传代后可减弱毒性。Pols曾使得贝诺孢子虫在兔体内成功传了19代。证明在兔体内传代是可以实现的，兔可以作为实验动物。还有学者将贝诺孢子虫感染金黄地鼠、海猪、小白鼠和美利奴绵羊，同时进行系统观察，最终在其体内发现虫体，并表现出比感染牛、羊等大型动物严重的急性症状，这可能与接种动物个体较小，虫体密度大及小型动物耐受性低等因素有关。

1.2寄生部位及形态特征牛体内寄生的为贝氏贝诺孢子虫，寄生于中间宿主体内的形式为包囊和速殖子，这点与弓形虫相同。其包囊可寄生于病畜的皮肤及皮下疏松结缔组织、巩膜、筋膜、鼻腔黏膜、舌、咽、阴道及内脏等许多部位。发热期速殖子出现在血液中，并且可在肺、睾丸、淋巴结发现。

包囊为球形，色灰白，呈细砂粒样，一般呈散在分布，肉眼则能识别。包囊直径约为200～600 μm不等，其大小随寄生部位的不同差异很大。包囊囊壁由宿主组织所形成，具有很厚的富有弹性的透明化均质胶原纤维层外膜，目前认为外膜完全由宿主细胞的生理反应形成的［4］；内层膜较薄。由于这种双层的囊壁，使贝诺孢子虫明显区别于顶复门其他寄生虫。且包囊内含有胞浆，胞浆内含有大量缓殖子，通常一端稍尖，一端钝圆，其大小为2～5×6～12 μm，呈香蕉形，新月形或梨形。在急性病牛的血涂片中有时可见速殖子，其形态与缓殖子相似，大小为6～7.5×2.5～3.9 μm。在光学显微镜下，贝诺孢子虫的速殖子与新孢子虫、弓形虫的速殖子无法区分。有研究者用贝诺孢子虫速殖子感染Vero细胞［5］，最终确定其复制的方式为孢内生殖，且复制的速率取决于细胞系，目前报道的最好的复制速率来源于BHK21细胞（幼年叙利亚地鼠肾细胞）的每小时感染6～20个速殖子。

2　生活史及传播方式

目前仅有个别虫种贝诺孢子虫的生活史较为清楚，但对如贝氏贝诺孢子虫等流行性较高的虫种，其生活史尚不清楚，有人认为其生活史与弓形虫相似，带有虫体的组织被猫食入后，于肠上皮细胞固有层内进行裂殖生殖和配子生殖，产生类似等胞球虫的卵囊，随后排出体外，被宿主吞食。进入宿主体内破裂释放速殖子，速殖子侵入血液，引起相应症状并随血液到达身体各处，最终于组织内形成包囊并转变为缓殖子。

模仿接种弓形虫的方法，从猫体内分离的包囊通过口腔感染牛，到目前为止还未获得成功的报道。然而现已证明贝诺孢子虫可通过吸血昆虫进行机械传播。因此绕过了有性生殖和无性生殖，同时也解释了为何呈季节性流行。通过机械传播的方式使贝诺孢子虫可以随意感染各地的牛，使其流行于世界各地，这也解释了为何贝诺孢子虫的生活史至今未被确定。有研究者从牛的泪液中发现速殖子，这表明贝诺孢子虫可以通过不吸血的蝇类或一些吸食眼泪的昆虫传播［6］。

3　临床症状

贝氏贝诺孢子虫的感染临床表现为急性期和慢性期，急性期发生于感染后的11～13 d，持续6～10 d。慢性期则持续整个急性期的恢复阶段，并可以延续一生。

急性期发生速殖子的快速扩散，速殖子的扩散发生于血管内的巨噬细胞、内皮细胞和纤维母细胞，导致血管的相应病症，如血管阻塞及炎症，常发生于毛细血管和小静脉、皮下组织、筋膜、睾丸和上呼吸道黏膜。急性期临床表现为高热、呼吸障碍、心率加快、食欲不振、产奶量下降，常伴随浅表淋巴结慢性细胞性淋巴结炎、皮肤水肿、公牛急性睾丸炎等，并且由于呼吸困难易导致上呼吸道黏膜炎。急性期不一定会导致动物死亡，但这个过程会导致动物身体状况严重下降。

急性期持续1～2周后，水肿减弱，进入慢性期。慢性期包囊略有增大，同时缓殖子数量增多，有的缓殖子可以在包囊内存活数年，并随包囊一起寄生于皮肤、皮下组织、肌间筋膜。慢性期会导致动物间歇发热，厌食，同时伴有皮肤病变，如不同程度的脱毛，皮肤显著增厚、硬化、龟裂、出现褶皱，流出浆液性血样液体，严重者呈象皮样变性。皮肤病变主要发生于病畜的颈部、肩部。病变皮肤和脱毛将永久性伴随患畜，表现为不可逆性。皮肤病变偶发于四肢，导致行动困难和疼痛。公牛阴囊肿大，睾丸实质和输精管被大量包囊阻塞，导致不育。也会导致怀孕母牛流产，严重感染的母牛可能永久性不孕。除表现显著特征的皮肤病变外，一些小的包囊肉眼可见于巩膜和雌性外阴道，这一特征在临床诊断方面有重要意义。

现如今，虽然牛贝诺孢子虫的很多特性已被破解，但是在临床方面用于确诊的临床特征难以确定，经常会被误诊为牛瘟、疥疮、真菌感染等。并且很多病畜呈不同程度的隐性感染，巩膜等处无明显包囊，给确诊该病带来困难。

4　诊断方法

患病动物皮肤，眼巩膜或阴道出现包囊时，结合脱毛、皮肤增厚、结痂等症状可作出初步诊断，但易造成误诊，仍需实验室诊断才能最终确诊。

对于表现出明显病理变化的患病动物可采取组织病理学方法，在病变皮肤处通过穿刺的方式取样或直接采集巩膜的结节做压片或切片，通过TEM观察到包囊及缓殖子均可确诊。对于一些体表病变较轻的患病动物，应采用PCR方法检测贝诺孢子虫DNA。尽管存在检测隐性感染可能呈阴性的局限性，PCR在未发现贝诺孢子虫抗体的情况下仍作为检测病牛血液中速殖子的合适方法［7］。

由于多数患病动物呈隐性感染，为更准确地对贝诺孢子虫进行诊断，血清学诊断方法取得了很大成果。检测患病动物血清中是否存在抗体是很好的检测方法。王祥生曾用病牛病变皮肤分离的虫体包囊内的缓殖子制备抗原，并成功接种于牛，血凝抗体于接种后10 d出现阳性反应，比临床症状早出现40～50 d，肯定了抗原在贝诺孢子虫诊断中的可靠性。

IHA和CFT是诊断贝诺孢子虫有效的血清学方法，具有阳性符合率较高的特点，并且方法简便易行，可现场应用。尤其IHA，更适用于患畜的早期诊断。国内研究者王祥生、胡力生等多次采用IHA检测贝诺孢子虫，均起到很好的检测效果。IFAT被认为是血清学检测的黄金标准，在对隐性感染的检测时能取得良好效果，但应注意避免交叉反应。Western Blot也可以用于其检测，目前应用Western Blot进行检测时常与牛新孢子虫等原虫病发生交叉反应，但Western Blot已被确立为其他方法的验证试验方法［8］。姜言辅曾应用ELISA进行检测，阳性检出率明显高于巩膜检查结果。据报道，现已有用于检测贝诺孢子虫的ELISA试剂盒。也有研究称，血清学检测对于隐性感染的灵敏性不高，这可能与检测季节昆虫的活跃度有关，昆虫较少或无昆虫的季节，各种检测方法的结果均偏低。

5　治疗与预防

贝诺孢子虫和弓形虫同属球虫目内双芽球虫亚目，形态结构比较相似。然而，在治疗方面，对弓形虫病有效的药物还没有一种能对贝诺孢子虫起作用。最早有人采用静脉注射30 mL浓度为1%福尔马林进行治疗，但由于伴随明显的不良反应而被弃用。Pols早在1960年就曾在接种贝诺孢子虫的兔身上尝试过喷他脒、金霉素、福尔马林、等药物，均未能成功达到良好的抑制或治疗效果。柳春华等曾验证丙硫咪唑和氯苯胍口服对急性病牛治愈率很高；吡喹酮和甲醛液对慢性病牛有一定的治疗作用，但不能根治。刘学敏等也曾进行过药物治疗试验，同样证明吡喹酮能杀死患牛体内大部分虫体，但以四肢为代表的远端筋膜、跟腱处仍有虫体残留。韩国应用1%锑制剂对人工接种牛源贝诺孢子虫的山羊进行治疗，结果取得满意效果。也有学者表示，氢化可的松和那嘎宁均可对贝诺孢子虫病起到一定治疗或缓解作用，由于实验动物较少，其准确性有待确定。

近年来，有研究者先后利用Vero细胞应用一些药物及其衍生物，能够实现对贝诺孢子虫速殖子增殖的抑制作用，有的药物甚至能引起严重的超微结构改变，并获得相比于有毒的硝基化合物更安全的效果，但是相应的研究尚未在动物身上进行。

Niagi［9］通过速殖子免疫的小鼠制备单克隆抗体，能够在贝诺孢子虫速殖子侵入单层细胞时表现明显的抑制作用，而后续研究尚未报道。最新的研究表示能够在贝诺孢子虫速殖子、缓殖子分别表达的抗原已被确定，这对后续的研究具有重大作用。目前可用于贝诺孢子虫分子水平的研究成果不多，并且缺少好的实验动物模型，所以贝诺孢子虫基因组及转录组的测序是在分子水平上进行系统分析研究的必然基础。

目前，本病的治疗尚处于探索阶段，因此，预防工作倍显重要。在一些贝诺孢子虫呈地方性流行的农场，病死的牛经焚烧、深埋等方式小心处理，从而消除传染源。可全年对牛群进行临床检查，以便及早发现处理病畜。同时，由于吸血昆虫和猫与本病传播有关，应采用合理的方法进行控制，可采用1%氯仿控制吸血昆虫。

［1］Cortes H，Leitão A，Gottstein B，et al.A review on bovine besnoitiosis：a disease with economic impact in herd health management，caused by Besnoitia besnoiti［J］.Parasitology，2014，9，141（11）：1406-1417.

［2］Bovine besnoitiosis：an emerging disease in Europe［J］.EFSA Journal，2010，8，1499：15.

［3］Olias P，Schade B，Mehlhorn H.Molecular pathology，taxonomy and epidemiology of Besnoitia species（Protozoa：Sarcocystidae）［J］.Infection，Genetics and Evolution，2011，11：1564-1576.

［4］Dubey J P，van Wilpe E，Blignaut D J C，et al.Development of early tissue cysts and associated pathology of Besnoitia besnoiti in a naturally infected bull（Bos taurus）from South Africa［J］.Journal of Parasitology，2013，99：459-466.

［5］Schares G，Basso W，Majzoub M，et al.First in vitro isolation of Besnoitia besnoiti from chronically infected cattle in Germany［J］. Veterinary Parasitology，2009，163：315-322.

［6］Liénard E，Salem A，Jacquiet P，et al.Development of a protocol testing the ability of Stomoxys calcitrans（Linnaeus，1758）（Diptera：Muscidae）to transmit Besnoitia besnoiti（Henry，1913）（Apicomplexa：Sarcocystidae）［J］.Parasitology Research，2013，112：479-486.

［7］Jacquiet P，Liénard E，Franc M.Bovine besnoitiosis：epidemiological and clinical aspects［J］.Veterinary Parasitology，2010，174：30-36.

［8］Schares G，Basso W，Majzoub M.et al.Comparative evaluation of immunofluorescent antibody and new immunoblot tests for the specific detection of antibodies against Besnoitia besnoiti tachyzoites and bradyzoites in bovine sera［J］.Veterinary Parasitology，2010，171：32-40.

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S852.72+3

A

0529-6005（2016）09-0066-03

2015-07-14

毕磊（1991-）、，男，硕士，从事贝诺孢子虫流行病学研究，E-mail：821165034@qq.com

路义鑫，E-mail：Luyixin@neau.edu.cn