以长白猪为受体母猪的手术法胚胎移植的体会

贾秀伟，吴　晶，孙之皓，张　舟，尹熙俊，李文学

（1.延边大学农学院动物医学系，吉林 延吉 133002；2.延边大学农学院动物科学系，吉林 延吉 133002）

以长白猪为受体母猪的手术法胚胎移植的体会

贾秀伟1，吴晶1，孙之皓1，张舟1，尹熙俊2，李文学1

（1.延边大学农学院动物医学系，吉林 延吉 133002；2.延边大学农学院动物科学系，吉林 延吉 133002）

胚胎移植技术是克隆猪、转基因猪等研究进行的基础。随着猪的繁殖生物技术的需要，猪胚胎移植技术也得到了快速发展。猪胚胎移植于1951年获得成功［1］，但因猪生理特点及其受精卵抵抗低温较弱等特点，直到1975年Cumock才将其应用于实际，胚胎移植技术作为一种猪群净化手段为世界所关注［2］。1989年我国成功得到猪胚胎移植后代，之后相继得到试管猪、克隆猪和转基因猪。胚胎移植技术是猪生产中不可或缺的技术环节，是猪繁殖和改良的重要手段。

1　材料与方法

1.1试验动物由吉林省龙井市农业科技研究所猪场提供的自然发情的经产长白猪母猪24头，健康状态良好，体重均在200 kg左右，术前禁食24 h、禁水6 h。

1.2胚胎（2～4cells）卵母细胞从延吉市屠宰场的猪卵巢中吸取获得、培养，体细胞是五指山猪耳细胞，胚胎由吉林省转基因动物与胚胎工程重点实验室构建。

1.3试验器材及药品常规外科手术器械；复方氯胺酮，购自沈阳市兽药厂，生产批号：20100605。

1.4麻醉与消毒母猪保定确实后，按2 mL/100 kg体重耳静脉注射复方氯胺酮；麻醉后，术部进行剪毛、剃毛、清洗、消毒。

1.5术式在倒数第一对乳头与第二对乳头之间的腹中线上做一长约15 cm左右的切口；常规切开腹壁，暴露腹腔；探查腹腔，将子宫角、输卵管及卵巢缓慢拉出腹腔外，观察输卵管伞、输卵管及卵巢的状态，用生理盐水浸湿的灭菌纱布覆盖其表面。术者撑开输卵管伞，并捋直输卵管壶腹部；同时，移卵助手将已吸入胚胎（约150枚左右）的导管，通过输卵管伞腹腔口将胚胎注入输卵管峡部；将子宫、输卵管及卵巢还纳腹腔，常规关闭腹腔。在切口处涂抹抗菌软膏，然后喷涂伤口修复液。

1.6术后护理术后将受体母猪移至架空式产床，不应用抗生素，常规饲养。

1.7妊娠诊断22 d后使用B超结合猪早孕检测试剂盒进行妊娠诊断。

2　结果

2.1受体母猪在术后1～2 d，出现食欲减退，个别受体母猪（3/24）体温有所升高；术后3 d，受体母猪食欲恢复正常，体温正常。

2.2经检测24头受体母猪，11头妊娠；妊娠母猪共分娩67头克隆仔猪，母猪平均产仔率约为6只/头，其中新生仔猪因各种原因死亡22头。

3　讨论

3.1移植的条件（1）受体母猪：受体母猪的选择有大型猪和小型猪之分，Hoshino［3］等研究表明，大型猪似乎更适合作为小型猪克隆胚胎的移植受体。本试验选用长白猪这种大型母猪作为受体母猪。有研究称经产母猪作为受体母猪产仔数及克隆效率均高于青年母猪，可能因为其激素水平相对稳定，胚胎易于着床，且有较大的子宫容量，当胚胎存活的数量充足时，胎盘的大小和子宫的容量就会影响到最终的产仔数量［4］。本试验选用经产母猪作为受体母猪。罗学明等［5］研究表明，处于即将排卵或正在排卵阶段的受体母猪比排卵前阶段或完全排卵阶段的受体母猪妊娠率高很多。本试验选用处于即将排卵或正在排卵阶段的母猪作为受体母猪，卵巢状态良好，有5 mm以上的大卵泡，输卵管伞充血，输卵管壶腹部充血扩张，且直径约为峡部的2～3倍左右；（2）移植方法：猪的胚胎移植法有3种：分别为手术法、非手术法以及内窥镜法。其中以手术法为主，因为猪生殖道形态特殊，子宫颈深，皱褶又多，将输卵管由子宫颈送入到子宫有一定难度且子宫角长，弯曲多，容积大，非手术法进行移植难度相当大，而内窥镜移植法进行实验时视野狭窄，操作难度很大。输入胚胎方法目前主要有两种，由输卵管腹腔口移植和输卵管打孔移植，研究表明，克隆胚胎经由输卵管腹腔口移植比输卵管打孔移植具有更高的移植分娩率和克隆猪效率［6］，输卵管打孔移植虽然操作简单，但可能由于打孔时的刺激或者造成出血等原因，导致猪胚胎移植效果并不理想。故本试验采用输卵管腹腔口移植胚胎，受体母猪妊娠率为45.83%（11/24），11头受胎母猪共分娩67头克隆猪；（3）胚胎的发育阶段及移植部位：移植的猪体细胞克隆胚胎发育阶段与受体母猪子宫或输卵管发育阶段的相匹配性是提高胚胎移植效率的至关重要的影响因素，如果不匹配就可能导致胚胎着床失败［5］。据研究表明，将胚胎移入子宫角中部和尖端时的妊娠率远远高于胚胎植入子宫体的妊娠率，而且进行一侧输卵管的移植，胚胎也可到达另一侧子宫角。因为本试验是将2～4细胞胚胎移入，综合母猪的生理状态将胚胎移入输卵管峡部。猪体细胞克隆胚胎移植后的受胎率从29%～100%不等，一般在30%～50%［7］。本试验妊娠率45.83%（11/24）。针对猪胚胎移植的阶段不同研究者有着不同的研究结论，Vajta等［7］人认为一般在1～4期细胞阶段进行手术法移植。也有人认为4～8细胞期最好，8～16细胞期次之，而桑椹胚至囊胚效果不理想［8］；本试验选用2～4细胞期的胚胎进行移植；（4）胚胎的数量：一般认为克隆胚胎的质量不如体内胚胎，故胚胎移植时常常将大量的猪克隆胚胎移入子宫或输卵管内。克隆胚胎的个数往往在几十枚和上百枚之间［8］。本试验进行移植时移入150枚左右的胚胎。

3.2麻醉药的选择据Fanchin［9］等的研究表明，在人的胚胎移植中，子宫的刺激收缩对胚胎移植后的妊娠率有很大影响。所以麻醉不仅能减少疼痛对受体机体及子宫的影响，而且有助于提高胚胎移植成功率。在实验猪的麻醉方法及麻醉剂的选择与用量方面国内外都做了很多研究，但大部分研究是针对小型猪。本试验采取的是耳静脉注射复方氯胺酮，约10 s即可进入麻醉状态且可维持麻醉效果约40 min，此麻醉方法进入麻醉状态快，无呕吐，无明显流涎，无需麻醉前给药，方便可行，尤其是针对40 min内可以完成的手术如胚胎移植手术，非常适用。

3.3是否应用抗生素研究表明，抗生素对发育中的胎儿可能存在致畸或毒性作用［10］。为了避免使用抗生素可能对胚胎在受体母猪妊娠造成的不利影响，本试验术后未使用任何抗生素。经观察，虽未使用抗生素但是创口并无感染、化脓等炎性症状，对猪创口的愈合无不良影响。这得益于术前的充分清洗、严格消毒及无菌操作，缝合后使用伤口修复液覆盖伤口，可使切口快速愈合，且避免细菌感染。

［1］冯伯森，王秋雨，胡玉兴.动物细胞工程原理与实践［M］.北京：科学出版社，2000.

［2］王建辰.防止通过胚胎移植传播疾病［J］.国外兽医学，1998（4）：24-28.

［3］Hoshino Y，Uchida M，Shimatsu Y，et al.Developmental competence of somatic cell nuclear transfer embryos reconstructed from oocytes maturedin vitrowith follicle shells in miniature pig［J］.CloningStem Cells，2005，7：17-26.

［4］Wilson M E，Vonnahme K A，Ford S P.The role of altered uterine-embryo synchrony on concepts growth in the pig［J］.Journal of Animal Science，2001，79（7）：1863-1867.

［5］罗学明，张卫红，冯冲，等.受体母猪排卵状况对体细胞克隆胚胎移植效率的影响［J］.畜牧兽医学报，2010，4103：366-370.

［6］卫恒习，李秋艳，高凤磊，等.胚胎移植方法和受体母猪因素对克隆猪生产效率的影响［J］.中国农业科学，2012，45（15）：3147-3153.

［7］Vajta G，Zhang Y，Machaty，Z Somatic.cell nuclear transfer in pigs:Recent achievements and future possibilities［J］.Reprod，Fertil and Develop，2007，19（2）：403-423.

［8］卢晟盛，吕培茹，刘红波，等.广西巴马小型猪克隆胚的构建及胚胎移植［J］.动物学杂志，2008，43（6）：147-153.

［9］Fanchin R，Righini C，Olivennes F，et al.Uterine cont ractions at time of embryo transfer alter pregnancy rates after in vitro fertilization［J］.HumReprod，1998，13：1968-1974.

［10］苗丽，邓万俊.妊娠及哺乳期应用抗生素的研究现状［J］.国外医药抗生素分册，2008，29（6）：248-252.

S828

B

0529-6005（2016）09-0053-02

2015-07-10

国家转基因重大专项基金支持项目（2009ZX0800-6-002B）

贾秀伟（1990-），女，硕士，主要从事小动物临床研究，E-mail：jiaqiqi640@163.com

李文学，E-mail：liwx@yub.edu.cn