提高DNA疫苗免疫效果研究进展

史雪萍，樊晓旭

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109；2.中国动物卫生与流行病学中心 外来病研究中心，山东 青岛 266032）

提高DNA疫苗免疫效果研究进展

史雪萍1，樊晓旭2

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109；2.中国动物卫生与流行病学中心 外来病研究中心，山东 青岛 266032）

DNA疫苗本质上是质粒，包括真核表达载体和整合到载体上的表达特定基因的序列。DNA疫苗通过特定的递送方式进入宿主细胞核，载体携带的特定抗原基因发生转录，mRNA随即至细胞浆，翻译成抗原蛋白。不同于传统的蛋白或多肽疫苗，DNA疫苗免疫宿主后，所表达的抗原（蛋白或多肽）能够在基质细胞（如肌肉细胞）和树突状细胞中表达，这些抗原经过处理，激活B淋巴细胞，诱导产生抗体，发挥体液免疫应答效应；抗原与MHC II和MHC I分子结合，经抗原递呈细胞递呈活化CD4+或CD8+T淋巴细胞，发挥细胞免疫应答效应；此外，转染的质粒DNA本身同样可能通过绑定胞浆内非特异性的DNA识别受体，激活TBK1-STING通路，产生I型干扰素，诱导产生先天性免疫反应，同时发挥佐剂效应，促进适应性免疫应答［1］。自1992年首次报道DNA疫苗研究以来，已有马用西尼罗河热DNA疫苗（West-Nile-Innovator）、鱼用传染性造血组织坏死病毒DNA疫苗（Apex-IHN）、犬用癌症治疗性DNA疫苗（Oncept）、提高仔猪存活率的生长激素基因治疗性DNA疫苗获得批准上市［2］。但是，在实际应用中，DNA疫苗往往因免疫效果差被广为诟病，特别是DNA疫苗的免疫效果因不同物种而异。因此，如何提高DNA疫苗的免疫效果成为当前DNA疫苗成功应用的难点所在。文章拟从质粒的提高目的基因表达、增强质粒的递送效果、模拟免疫佐剂效应方面，介绍提高DNA疫苗免疫效果的研究进展。

1　提高目的基因表达，增强免疫效果

在DNA疫苗的研制中，首先要考虑和选择质粒类型及其组成，包括其中启动子、筛选形式、复制方式，以保证质粒的产量和质量。DNA疫苗载体由负责表达转入基因的真核区和提供选择和复制的大肠杆菌原核区组成。其中，真核区包括了上游负责转录成mRNA的启动子和下游介导mRNA剪切和多聚腺苷化的多聚腺苷信号（见中插彩版图1）。启动子是在外源基因转录过程中首先和RNA聚合酶结合的一段DNA序列，与基因的转录起始有关。通过比较了5种病毒和5种细胞启动子的启动活性发现，将不同启动子分别插入同一载体中的荧光素酶启动子之前，在接种质粒后，小鼠荧光素酶的表达情况有强弱之分，结果表明，他们启动转录的能力各不相同，因而对外源基因表达影响很大，巨细胞病毒启动子（CMV）较其他病毒和细胞启动子有着更强的转录作用，可提高基因持续表达的时间。多聚腺苷酸信号序列多源于兔子的β球蛋白或牛生长激素基因。

在载体中，通常加入Kozak序列，该序列是位于真核生物mRNA 5’端帽子结构后面的一段核酸序列，多为“ACCACCAUGG”，该序列经胞浆中的核糖体识别，可以与翻译起始因子结合，从而介导mRNA的翻译，促进转入基因进行高效翻译。在DNA疫苗设计中，往往加入信号肽，增强抗原递呈效果，使抗原参与到不同的分泌系统，其中，可以选择异源的分泌信号，也可根据分泌蛋白，选择天然的信号肽。例如，使用优化的组织型纤溶酶原激活剂（TPA）信号肽或IgE先导基因［1］。在某些DNA疫苗，使用的N-末端的泛素标签（末端泛素残基G76A破坏融合蛋白）促进MHC I类抗原呈递，泛素（Ubiquitin，Ub）是一个由76个氨基酸残基组成的蛋白质小分子，Ub与靶抗原基因的融合表达，可以使泛素化的靶抗原经蛋白酶体降解为8～10个氨基酸小肽，这些短肽被迅速加工、处理和递呈，并刺激机体MHC I类分子限制的特异性CD8+T淋巴细胞增殖、分化，从而诱发特异性的CTL反应，达到增强DNA疫苗免疫效果的目的，但同时降低了抗体水平。在N末端插入供MHC I和MHC II类分子结合的多肽，将泛素与目的蛋白融合表达以增强细胞免疫功能，已成为核酸疫苗设计中的一条新思路。

2　增强质粒在体内的递送效果，更好的促进机体产生免疫应答

目前，已开发了多种DNA递送技术，包括金颗粒轰击（基因枪），DNA无针喷射注射，DNA纹身，脂质体包裹DNA经皮电穿孔注射等。金颗粒轰击是通过动力系统将带有基因的金属颗粒，以一定的速度射进细胞，由于小颗粒穿透力强，基因可直接进入基因组，从而实现稳定转化的目的。早期研究发现，使用金粒子包裹DNA轰击小鼠皮肤，提高了质粒的传递效率。DNA喷流注射装置Biojector 2000，无需针头，通过产生极细高压流穿透皮肤，将液体药物递送至体内。狂犬病病毒核酸疫苗接种中运用了这种技术，通过在耳内面喷射DNA，相比皮下或肌肉注射细胞培养的疫苗Rabisin，可诱导产生更高滴度、更持久的病毒中和抗体。DNA纹身是另一种递送DNA的方法，能够促使基因在皮肤的表皮层和真皮层高效表达。这种方法相比肌肉注射DNA能够诱导更强的特异性细胞、体液免疫应答。此外，纹身过程会导致许多轻微的机械损伤，如出血，坏死，炎症和皮肤再生，从而非特异性的刺激免疫系统。纹身方法免疫小鼠后，表现出的炎症反应更强烈。DNA疫苗临床试验主要选择肌肉注射和皮内注射的方式［3］。但是，直接以裸DNA接种会有以下不足：仅有小部分肌细胞摄取DNA、DNA暴露与组织间的核酸酶攻击下、DNA用量相对较大、必须加强免疫。而通过脂质体接种包被的质粒DNA，有利于抗原递呈细胞的摄取，同时还能保护DNA免受核酸酶的攻击。在HIV疫苗免疫猕猴实验中，用脂质体包裹DNA免疫，要比使用5倍剂量裸DNA免疫诱导产生的ELISA抗体高10～40倍［4］。通过猪和猕猴免疫实验进一步证实，使用电穿孔方式经皮肤免疫体积较大动物可获得更好的体液免疫和细胞免疫效果。随着纳米技术的发展，人们使用层状双金属氢氧化物二氧化硅纳米颗粒包裹编码新城疫病毒F基因的质粒DNA，相比直接肌肉注射质粒DNA，滴鼻免疫SPF鸡，可达到更好的缓释效果，同时诱导产生较强的细胞、体液、黏膜免疫反应，攻毒保护效果更佳［5］。

3　模拟佐剂效应、活化干扰素信号通路，提高疫苗免疫原性

在疫苗应用中，尤其是灭活苗、蛋白质亚单位疫苗，常添加佐剂，引起局部炎症反应、形成缓释效应，增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。目前在已批准上市的鸟用和犬用DNA疫苗中，使用了氢氧化铝佐剂。在获批上市的马用WNV DNA疫苗，使用的是Meta Stim水包油佐剂［6］，但在DNA疫苗中使用氢氧化铝佐剂的实验研究发现，疫苗能够显著提高免疫小鼠的体液免疫水平，但在非人类的灵长类动物体内，这种免疫增强效果并不明显；随着宿主免疫机制研究的深入，人们进一步确定了免疫DNA疫苗活化的信号通路，进而提高疫苗的免疫效果。研究表明，在DNA疫苗中加入特定的CpG基序，可供宿主TLR9识别和活化，提高先天性免疫应答效果，如使用阳离子脂质体包被含有CpG基序的质粒DNA免疫后可显著增强肺部炎症反应［7］。在DNA疫苗免疫中，可同时使用免疫编码“佐剂”蛋白的质粒，如编码IL-12、RANTES、CD40、免疫刺激RNA（isRNA）等，可提高疫苗的免疫效果。用含有流感HA片段的质粒与表达MDA5的质粒共同免疫鸡，可提高对H5亚型流感感染的免疫保护［8］。

目前通过使用DNA疫苗免疫基因敲除小鼠发现，TLR9、MyD88/TRIF、DAI、RIG-I和MDA5下游接头分子IPS-1对于DNA疫苗免疫效果无影响，而小鼠分别缺失了STING、TBK1、IRF3和IFNαR2后，削弱了DNA疫苗的免疫效果。TBK1诱导产生I型干扰素包括了TLR依赖和TLR非依赖途径。位于内质网上的STING，受到细胞质内各种dsDNA的活化，与TBK1一并从内质网重新定位至核周小泡，最终与诱导的IκB激酶（IKK-i）将IRF3和IRF7磷酸化，活化IRF3/IRF3通路，刺激产生I型干扰素［9］。如将编码TBK-1的质粒和目的抗原质粒各50 μg肌肉注射小鼠，能够提高恶性疟原虫疫苗的体液免疫效果［10］。此外，小分子血管阻断剂（DMXAA），模拟病毒感染产物dsDNA，在无TLRs和RNA解旋酶的参与下，仅通过TBK-1-IRF3信号通路诱导I型干扰素的大量产生。无独有偶，抗病毒成分（CMA）能够通过STING-TBK-1-IRF3诱导产生I型干扰素。ZBP1/ DAI，称ZBP1，Z-DNA绑定蛋白1，也称作DAI，DNA依赖的干扰素调控因子激活剂，或DLM-1，在体外实验中发现，该蛋白能够直接绑定dsDNA，增强其与IRF3和TBK1的相互作用，激活DNA介导的先天性免疫反应［11］。但是，DAI作为胞内DNA识别受体其功能尚存争议，因为DAI在DNA诱导干扰或免疫DNA质粒后仍然能够正常的产生干扰素，DAI在人体先天性免疫信号通路中的作用需要进一步验证。近来研究发现，AIM2（黑色素瘤2缺失蛋白）、IFI16（γ干扰素诱导蛋白16）、HMGB（高迁移率族蛋白B1）、TRIM56（三重基序蛋白56）、DDX41（为DEXDc解旋酶家族成员）、RNA聚合酶III、cGAS（环磷酸鸟苷-磷酸腺苷（cGAMP）合成酶）功能缺失会影响DNA诱导的I型干扰素的产生［12］。因此，DNA疫苗的佐剂效果主要依赖于干扰素发挥作用。

综上，DNA疫苗作为新兴的生物技术产品，其研究方兴未艾，特别是目前在小鼠模型中取得了令人欣喜的结果。但在大动物中该类疫苗免疫效果往往不佳。当前，在DNA疫苗的设计和改进上，人们重点考虑的是如何提高疫苗的递送效率、增强抗原的表达和免疫原性，尽管研发道路依旧曲折而漫长，但随着生物技术的发展和人们认知的深入，DNA疫苗定会作为一种有力的“武器”，应用于某些疾病的治疗及传染病的控制与根除中去。

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R 392.11

A

0529-6005（2016）09-0060-03

2016-03-18

史雪萍（1972-），女，高级兽医师，硕士，从事动物生产及动物疫病研究，E-mail：sapqdau@tom.com

樊晓旭，E-mail：fanxiaoxu@cahec.cn