白细胞介素-18在糖尿病肾病大鼠模型中的表达水平及其对尿液肾损伤分子-1的影响

张孟姝　刘金磊　张春梅　刘学政

(辽宁医学院附属第一医院，辽宁　锦州　121001)



白细胞介素-18在糖尿病肾病大鼠模型中的表达水平及其对尿液肾损伤分子-1的影响

张孟姝刘金磊张春梅1刘学政2

(辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州121001)

〔摘要〕目的探讨白细胞介素(IL)-18在糖尿病肾病(DN)患者以及2型DN大鼠中的表达水平及其对尿液肾损伤分子(KIM)-1的影响机制。方法通过对高脂高糖高能量饲料喂养加小剂量注射链脲佐菌素(STZ)诱导2型DN大鼠，检测大鼠血清及组织中IL-18的表达水平以及尿液中KIM-1的水平。并通过对2型DN大鼠注射IL-18的中和抗体后，观察血清及组织中IL-18的表达水平。结果与正常大鼠比较，STZ诱导的2型DN大鼠血清中IL-18的表达水平均显著增加，且外周血单核细胞表达IL-18的mRNA水平显著增加(均P<0.001)；此外，2型DN大鼠尿液中KIM-1的水平显著增加(P<0.001)。对2型DN大鼠注射IL-18的中和抗体后，大鼠尿液中KIM-1的水平显著降低(P<0.001)。结论IL-18可能对DN的发生发展有着一定的促进作用，该作用机制可能是通过影响尿液中KIM-1水平实现的。

〔关键词〕白细胞介素-18；尿液肾损伤分子-1；糖尿病肾病

糖尿病肾病(DN)是糖尿病最重要的微血管并发症之一，已成为糖尿病患者致死的主要原因〔1〕。白细胞介素(IL)-18具有多种多样的生物学活性〔2〕。多项研究提示了IL-18在糖尿病患者的发病及发展过程中发挥重要的作用〔3～6〕，然而，关于IL-18在DN中的作用研究尚不完全。本文旨在研究 IL-18 在DN患者中的表达水平，探讨其与DN的关系。此外，通过采用DN大鼠的研究模型探讨IL-18对肾脏损害的分子机制。

1资料与方法

1.1动物模型建立雄性SD大鼠(n=6)禁食15 h后，高脂高糖高能量饲料喂养大鼠，并使用链脲佐菌素(临用前以0.1 mol/L，pH=4.2柠檬酸缓冲液溶解新鲜配置)按剂量60 mg/kg体重腹腔注射1次，于注射后72 h后取大鼠尾静脉血测血糖，凡血糖≥16.7 mmol/L确定为糖尿病大鼠模型制作成功。

1.2主要试剂采用Trizol试剂盒(Life Technologies)提取组织及血清中的RNA；采用美国PROMEGA公司cDNA逆转录试剂盒对RNA进行逆转录；PCR试剂盒购于北京天恩泽公司。酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购自上海拜力生物科技有限公司。

1.3逆转录反应对于外周血标本：将新鲜的抗凝血用无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)以1∶2体积比混匀稀释。缓慢加入淋巴细胞分离液中，2 000 r/min离心20 min，小心吸取中间层的外周血单核细胞。取1×106外周血单核细胞，加入到1 ml的Trizol后，按照说明书的要求抽提总RNA，所得RNA溶于25 μl焦碳酸乙二酯(DEPC)处理水。提取的总RNA经紫外分光光度计进行定量。进一步对所得RNA逆转录成cDNA，并将其于-20℃保存备用。IL-18引物序列为正义：5′-GCTTGAATCTAAATTATCAGTC-3′，反义：5′-GAAGATTCAAATTGCATCTTAT-3′〔7〕。对照采用 U6作为内参：序列为正义：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反义：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反应条件：95℃变性20 s，然后60℃ 20 s和70℃ 1 s进行50个循环。采用美国ABI公司的7900型号Real-Time PCR仪器进行分析，最终结果采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析〔8〕。

1.4ELISA法检测血清IL-18采用上海拜力生物科技有限公司的人和大鼠的ELISA试剂盒检测血清中IL-18的水平，具体步骤参考试剂盒说明书。

1.5统计学方法采用SPSS19.0软件进行t检验和Pearson相关分析。

2结果

2.1DN大鼠血清IL-18与尿液KIM-1的水平DN大鼠血清IL-18水平显著高于正常大鼠〔(57.41±12.63)pg/ml vs(8.31±1.47)pg/ml，t=9.46，P<0.001〕；同时，DN大鼠外周血单核细胞IL-18的mRNA水平显著高于正常大鼠(7.11±2.33 vs 1.11±0.27,P<0.001)。此外，2型DN大鼠尿液中KIM水平显著高于正常大鼠〔(97.27±23.12)pg/ml vs(13.45±3.45)pg/ml，t=8.78，P<0.001〕。

2.2DN大鼠中和IL-18后抑制尿液KIM-1的水平注射了IL-18的抗体后，大鼠体内的IL-18显著降低〔(51.23±11.45)pg/ml vs(15.23±5.41)pg/ml〕(P<0.05)，且大鼠尿液中KIM的水平显著降低〔(42.26±16.23)ng/ml vs(93.45±21.33)ng/ml，t=8.78，P<0.001〕。

3讨论

DN是糖尿病的主要慢性并发症之一，也是导致终末期肾病的主要病因之一。目前，研究认为DN受多方面因素(血流动力学因素、代谢因素、遗传因素、氧化应激等)影响。近年来，DN亦被认为是一种由糖脂代谢紊乱引发的炎性反应性疾病。越来越多的证据表明，固有免疫细胞的活化与慢性炎性反应是DN 的一个公认的发病因素〔9〕。细胞的激活和炎性分子的释放，协同其他机制促使炎性反应的发生，是DN持续发展的关键性因素。研究认为，肾脏固有细胞在病理状态下可以产生肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1、一氧化氮(NO)及IL-6等多种细胞因子，从而参与DN的发病与发展〔10〕。然而其他的炎症因子与DN的关系研究尚不完全明确。

IL-18是另一类在人体内的多种细胞、多种组织器官中表达的细胞因子，其在正常状态下浓度很低，然而在某些应急状态下会产生高表达。有研究发现，将DN患者与非糖尿病患者进行比较，DN患者肾脏组织中的 IL-18 表达显著升高〔11〕，提示了IL-18可能会在DN的致病过程中发挥重要的功能，且炎症因子IL-18在DN的发病及发展中极其重要。Giunti等〔12〕发现2型糖尿病患者血清中IL-18水平增加，并且发现IL-18水平可以增加糖化血红蛋白(HbA1C)及空腹血糖(FPG)的浓度，从而进一步佐证了本研究的结果。

KIM-1是肾脏近曲小管上皮细胞一种跨膜糖蛋白，其在正常肝、脾、肾中微量表达，而在受损后再生的近曲小管上皮细胞中表达显著增强〔13〕，并能迅速、灵敏、特异地反映各种肾脏疾病的损伤及恢复过程。本研究结果提示炎症因子IL-18可能与肾脏损伤有着密切关系。这与之前研究的人群结果一致〔14〕。而且IL-18可能参与DN损伤的发生，而抑制细胞因子IL-18对于糖尿病患者的肾损伤可能有着直接的治疗作用。分析IL-18对DN的致病机制可能是通过促进TNF-α、IL-1β及干扰素(IFN)-γ等细胞因子的产生从而引起肾小球微循环发生改变、基质膨胀以及肾小球系膜细胞活化与增殖等病理过程〔15〕。

综上所述，IL-18的高表达在DN的发生、发展中起着重要的作用，其可能通过促进KIM-1水平来影响肾脏功能。抑制IL-18可能是临床上治疗糖尿病肾损伤的有效手段，值得临床进一步验证。

4参考文献

1Toyama T，Shimizu M，Furuichi K，etal.Treatment and impact of dyslipidemia in diabetic nephropathy〔J〕.Clin Exp Nephrol，2014；18(2)：201-5.

2Fabbi M，Carbotti G，Ferrini S.Context-dependent role of IL-18 in cancer biology and counter-regulation by IL-18BP〔J〕.J Leukoc Biol，2015；97(4)：665-75.

3Kanai T，Kamada N，Hisamatsu T.Clinical strategies for the blockade of IL-18 in inflammatory bowel diseases〔J〕.Curr Drug Targets，2013；14(12)：1392-9.

4Gracie JA，Forsey RJ，Chan WL，etal.A proinflammatory role for IL-18 in rheumatoid arthritis〔J〕.J Clin Invest，1999；104(10)：1393-401.

5Wong CK，Ho CY，Li EK，etal.Elevation of proinflammatory cytokine(IL-18，IL-17，IL-12)and Th2 cytokine(IL-4)concentrations in patients with systemic lupus erythematosus〔J〕.Lupus，2000；9(8)：589-93.

6Tiret L，Godefroy T，Lubos E，etal.Genetic analysis of the interleukin-18 system highlights the role of the interleukin-18 gene in cardiovascular disease〔J〕.Circulation，2005；112(5)：643-50.

7Hou J，Wang P，Lin L，etal.MicroRNA-146a feedback inhibits RIG-I-dependent Type I IFN production in macrophages by targeting TRAF6，IRAK1，and IRAK2〔J〕.J Immunol，2009；183(3)：2150-8.

8Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method〔J〕.Methods，2001；25(4)：402-8.

9Crook M.Type 2 diabetes mellitus：a disease of the innate immune system? An update〔J〕.Diabet Med，2004；21(3)：203-7.

10Mima A.Inflammation and oxidative stress in diabetic nephropathy：new insights on its inhibition as new therapeutic targets〔J〕.J Diabetes Res，2013；2013：248563.

11Miyauchi K，Takiyama Y，Honjyo J，etal.Upregulated IL-18 expression in type 2 diabetic subjects with nephropathy：TGF-beta1 enhanced IL-18 expression in human renal proximal tubular epithelial cells〔J〕.Diabetes Res Clin Pract，2009；83(2)：190-9.

12Giunti S，Tesch GH，Pinach S，etal.Monocyte chemoattractant protein-1 has prosclerotic effects both in a mouse model of experimental diabetes and in vitro in human mesangial cells〔J〕.Diabetologia，2008；51(1)：198-207.

13Nan-Ya K，Kajihara M，Kojima N，etal.Usefulness of urinary kidney injury molecule-1(Kim-1)as a biomarker for cisplatin-induced sub-chronic kidney injury〔J〕.J Appl Toxicol，2015；35(2)：124-32.

14Driver TH，Katz R，Ix JH，etal.Urinary kidney injury molecule 1(KIM-1)and interleukin 18(IL-18)as risk markers for heart failure in older adults：the Health，Aging，and Body Composition(Health ABC)Study〔J〕.Am J Kidney Dis，2014；64(1)：49-56.

15Liang D，Liu HF，Yao CW，etal.Effects of interleukin 18 on injury and activation of human proximal tubular epithelial cells〔J〕.Nephrology(Carlton)，2007；12(1)：53-61.

〔2015-08-10修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

〔中图分类号〕R517.1

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)06-1308-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.013

通讯作者：刘学政(1962-)，男，教授，博士生导师，主要从事糖尿病视网膜病变治疗方面的研究。

1锦州石化医院2辽宁医学院

第一作者：张孟姝(1982-)，女，硕士，主管护师，主要从事糖尿病并发症方面的研究。