HPLC法同时测定鸡眼草中染料木素和山柰酚的含量

靳　鑫，秦晓红，许　莉，宿　冰，穆晓婷，刘豪华，李亚丽，祝　峥，张东方*

HPLC法同时测定鸡眼草中染料木素和山柰酚的含量

靳鑫1，秦晓红2，许莉3，宿冰1，穆晓婷1，刘豪华1，李亚丽1，祝峥1，张东方1*

[摘要]目的建立HPLC同时测定鸡眼草药材中染料木素和山柰酚含量的方法。方法采用RP-HPLC法。色谱柱为Diamons C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-体积分数0.1%磷酸水溶液(体积比为72∶28)，流速为1.0 mL/min，检测波长为370 nm，柱温为30 ℃。结果染料木素和山柰酚质量浓度分别在0.50~4.02 mg/L和0.15~1.20 mg/L内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率分别为99.7 %和100.9%，RSD分别为0.1%和0.7% (n=6)。结论建立的方法简便，准确，重现性好，可用于鸡眼草药材中染料木素和山柰酚的含量测定。

[关键词]鸡眼草；染料木素；山柰酚；高效液相色谱；含量测定

[Abstract]ObjectiveTo establish a method for the simultaneous quantitative analysis of genistein and kaempferol in the aerial parts of Kummerowia striata with HPLC.MethodsThe chromatographic column was Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm);the mobile phase was methnol and aqueous solution containing 0.1 % phosphoric acid with the volume ratio of 72∶28 and the flow rate was 1.0 mL/min;the UV detection wavelength was 370 nm;the oven temperature was 30 ℃.ResultsThe linear ranges of genistein and kaempferol were 0.50~4.02 mg/L and 0.15~1.20 mg/L,respectively.The average recoveries (n=6) of genistein and kaempferol were 99.7% with RSD of 0.1%,100.9% with RSD of 0.7%,respectively.ConclusionThe method is simple and accurate,it can be used to determine genistein and kaempferol in the aerial parts of Kummerowia striata.

收稿日期：2015-04-03

通信作者*

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201512022

Simultaneous determination of Genistein and Kaempferol fromKummerowiastriataby HPLCJIN Xin1,QIN Xiao-hong2,XU Li3,SU Bing1,MU Xiao-ting1,LIU Hao-hua1,LI Ya-li1,ZHU Zheng1,ZHANG Dong-fang1*(1.School of Pharmacy,China Medical University,Shenyang 110001,China;2.Department of Pharmacy,Jianping Hospital of Liaoning Province,Chaoyang 122400,China;3.Traditional Chinese Medicine Research Institute of Liaoning Province,Shenyang 110041,China)

Key words：Kummerowiastriata;Genistein;Kaempferol;HPLC;Content determination

0引言

鸡眼草[Kummerowiastriata(Thunb) Schin-dl.]为豆科(Leguminosae)鸡眼草属植物，干燥全草入药，味苦，性凉，归胃、大肠经，有清热解毒、健脾利湿的功效，临床主要用于治疗胃肠炎、痢疾和泌尿系统感染，尤其对婴幼儿腹泻[1]和婴幼儿轮状病毒肠炎[2]有显著疗效，且服用安全。

据文献报道，从鸡眼草乙酸乙酯提取物中分离得到大量黄酮类化合物[3]，药理实验显示出较好的抗炎活性[4-5]，具有重要的开发价值。目前,对鸡眼草中的总黄酮进行含量测定多用紫外分光光度法[6]，但此法操作繁琐，干扰因素众多，实验精密度较差。为更好地控制鸡眼草药材及其产品的质量，本文建立HPLC法同时对鸡眼草中黄酮类成分染料木素和山柰酚的含量进行测定。

1仪器与试药

1.1仪器SHIMADZU UV-1700紫外-可见光检测仪(日本Shimadzu公司)，Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，SB4200DT超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)，BS110S分析天平(德国Sartorius公司 0.01 mg)。

1.2试药染料木素对照品(批号：111704-200501)、山柰酚对照品(批号:110861-200808)购自于中国药品生物制品检定所。鸡眼草购于河北安国药材市场(产地：辽宁，批号：20131026)，经中国医科大学张东方教授鉴定为鸡眼草Kummerowiastriata(Thunb) Schindl.地上部分。甲醇(色谱纯，山东禹王实业有限公司)，纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)，磷酸(分析纯，沈阳经济技术开发区试剂厂)，其他试剂均为市售分析纯试剂。

2方法与结果

2.1色谱条件Diamonsil C18色谱柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇-体积分数0.1%的磷酸水溶液(72∶28)，流速：1.0 mL/min，检测波长：370 nm，柱温：30 ℃，进样量：10 μL。见图1。

图1　对照品溶液(A)和供试品溶液(B)的HPLC图

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液精密称取染料木素对照品5.02 mg和山柰酚对照品5.01 mg，分别置于100 mL容量瓶中，用色谱甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得染料木素和山柰酚对照品质量浓度分别为50.2 mg/L和50.1 mg/L的对照储备液。精密量取染料木素对照品储备液1.0 mL和山柰酚对照品储备液0.3 mL，置于同一100 mL容量瓶中，用色谱甲醇定容，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液称取干燥至恒重的鸡眼草药材约1.0 g，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入色谱甲醇50 mL，称定质量，浸泡30 min后，超声提取30 min，取出放冷至室温，再称定质量，用色谱甲醇补足损失的质量，摇匀，滤过，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.3线性关系考察精密吸取混合对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，用色谱甲醇稀释，定容至刻度，摇匀。按“2.1”项色谱条件，注入液相色谱仪，记录峰面积。以各对照品溶液的质量浓度X(mg/L)为横坐标、色谱峰面积Y为纵坐标，求得回归方程，见表1。

2.4精密度试验精密吸取混合对照溶液10 μL，在“2.1”项色谱条件下，连续测定色谱峰面积6次，计算染料木素和山柰酚峰面积的RSD分别为0.8%和1.1%，表明仪器精密度良好。

表1　2种化合物的回归方程

2.5重复性试验取鸡眼草药材，按“2.2.2”项下方法平行制备供试溶液6份，在“2.1”项色谱条件下分析，计算染料木素和山柰酚峰面积的RSD分别为1.0%和1.7%。表明方法重现性较好。

2.6稳定性试验取同一供试溶液，室温放置，分别在0、2、4、6、8、10、12 h，按“2.1” 项色谱条件进样分析，计算染料木素和山柰酚峰面积的RSD分别为1.4%和0.9%，表明混合供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.7回收率试验精密称取干燥至恒重的鸡眼草药材各1.0 g，共6份。每份分别精密加入质量浓度为50.2 mg/L的染料木素对照储备液1.0 mL和质量浓度为16.5 mg/L的山柰酚对照储备液1.0 mL，混匀后干燥。按“2.2.2”项方法制备供试溶液，在“2.1”项色谱条件下分析，计算回收率。结果见表2。

表2　2种化合物回收率试验(n=6)

2.8样品测定精密称取干燥至恒重的鸡眼草药材3份，每份1.0 g，按“2.2.2”项方法制备，按“2.1”项方法进样，按外标法以峰面积计算鸡眼草药材中染料木素和山柰酚的含量。结果见表3。

3讨论

表3　鸡眼草中染料木素和山柰酚的含量(n=3)

3.1检测波长的考察取一定质量浓度的染料木素和山柰酚甲醇溶液，在200~400 nm波长范围内进行紫外扫描，染料木素在254 nm处有最大吸收，山柰酚在370 nm处有最大吸收。考虑到山柰酚含量较低，且染料木素在370 nm处也有较强的吸收，最终确定370 nm为检测波长。

3.2样品提取方法的考察本实验考察了70 ℃甲醇回流提取1 h和甲醇超声提取30 min两种方法对染料木素和山柰酚效率的影响。结果表明，两种提取方法的提取效率相当，因超声提取法操作简便、快速，故最终选择甲醇超声提取的方法。比较15、30、45、60 min不同超声时间对样品提取效率的影响。结果表明，超声30 min 可将染料木素和山柰酚甲醇提取完全，因此最终确定超声提取时间为30 min。

3.3流动相的考察染料木素和山柰酚均具有酚羟基，显弱酸性，在水中易发生电离，产生拖尾现象。为了改善拖尾峰形和提高分离度，可降低流动相的pH值，以抑制酚羟基电离[7]。笔者比较了流动相中加入不同浓度冰醋酸、甲酸和磷酸对样品分离的影响。结果表明，加入体积分数0.1%磷酸溶液作为酸化试剂时，可使峰形明显改善。

参考文献：

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[3]张宝徽，李芳芳，周牡娜，等.鸡眼草属两种植物中总黄酮的含量测定[J].湖北中医药大学学报,2012,14(1):33-35.

[4]Tao JY,Zhao L,Huang ZJ,et al.Anti-inflammatory effects of ethanol extract fromKummerowiastriata(Thunb.) Schindl on LPS-Stimulated RAW 264.7 Cell [J].Inflammation,2008,31(3):154-166.

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作者单位：中国医科大学药学院a.中心实验室，b.药物化学教研室，沈阳 110122